前已述及組織工程技術(shù)構(gòu)建軟骨及修復(fù)軟骨缺損的重要意義，并以豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型為例簡(jiǎn)單地介紹了軟骨缺損動(dòng)物模型的建立方法及注意事項(xiàng)。本節(jié)將分別以皮下軟骨構(gòu)建（彈性軟骨細(xì)胞）、關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)（透明軟骨細(xì)胞）及半月板軟骨缺損修復(fù)（纖維軟骨細(xì)胞）為例介紹三種類型軟骨組織的構(gòu)建方法及組織工程技術(shù)修復(fù)軟骨缺損的一般過(guò)程。

由于不同類型的軟骨在體內(nèi)存在部位不同，功能各異，因此，在軟骨組織構(gòu)建研究中，必須根據(jù)其各自的特點(diǎn)選擇適當(dāng)?shù)姆N子細(xì)胞與生物材料，并根據(jù)各自缺損修復(fù)的需要，對(duì)生物材料支架進(jìn)行塑形。

主要實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備與第4章第三節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基本一致，所不同的是在軟骨構(gòu)建過(guò)程中會(huì)根據(jù)需要選用不同的種子細(xì)胞與生物可降解支架材料。

一、彈性軟骨構(gòu)建方法

彈性軟骨在人體內(nèi)主要分布于耳郭及會(huì)厭等處，目前會(huì)厭軟骨構(gòu)建的研究相對(duì)較少，因此，這里簡(jiǎn)單介紹一下以耳郭軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞在皮下組織中構(gòu)建彈性軟骨的主要操作過(guò)程。

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

前面第4章第三節(jié)中已簡(jiǎn)要地介紹了豬耳郭軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)方法，這里仍以8～10周齡仔豬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。由于某些材料如聚羥基乙酸（PGA）在免疫功能完全的動(dòng)物體內(nèi)會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，所以對(duì)于這類材料一般要在體外或在裸鼠皮下進(jìn)行軟骨構(gòu)建。

（二）耳軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增

操作方法及注意事項(xiàng)同第4章第三節(jié)耳軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，一般用3代以內(nèi)的耳軟骨細(xì)胞進(jìn)行彈性軟骨構(gòu)建。

（三）生物支架材料的選擇

最簡(jiǎn)單實(shí)用的皮下軟骨構(gòu)建生物材料為聚氧化乙丙烯（Pluronic　F－127），它的最大優(yōu)點(diǎn)是在0～4℃時(shí)能配制成可流動(dòng)的液體，容易與細(xì)胞混合均勻，而在室溫或注射到動(dòng)物體內(nèi)后則形成不流動(dòng)的凝膠狀，操作方便，既能進(jìn)行一定程度的塑形，又不致引起細(xì)胞流失。此外，在皮下軟骨構(gòu)建研究中，也可根據(jù)不同研究需要選用膠原、纖維蛋白凝膠、殼聚糖／明膠膜、PGA、PGA－聚乳酸共聚物（PLGA）等。

（四）細(xì)胞－材料復(fù)合物制備及體內(nèi)植入

細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法前已述及，實(shí)驗(yàn)時(shí)將體外培養(yǎng)3代以內(nèi)的耳軟骨細(xì)胞消化、收集、計(jì)數(shù)備用。細(xì)胞－材料復(fù)合物的制備過(guò)程依所用生物材料不同而有較大的差別，這里分為液體材料（水凝膠類）及固體材料兩大類做一簡(jiǎn)要的介紹。

1．當(dāng)所用生物材料為液體（如Pluronic F－127、纖維蛋白凝膠等）時(shí)，應(yīng)先將細(xì)胞懸液離心，棄去上清液，濃縮的細(xì)胞團(tuán)打散，直接加入液體材料振蕩混合均勻，再用注射器將細(xì)胞－材料復(fù)合物注射到動(dòng)物自體皮下或裸鼠皮下。通常情況下，可注射性細(xì)胞－材料復(fù)合物中軟骨細(xì)胞的終濃度為（4～5）×107／ml。下面以Pluronic　F－127為例介紹具體操作步驟如下：

（1）材料準(zhǔn)備：將Pluronic　F－127溶于PBS，配制質(zhì)量百分比約30%的Pluronic－PBS凝膠，置于0～4℃冰箱內(nèi)磁力攪拌過(guò)夜，使Pluronic均勻溶解于PBS。高壓滅菌后再置于0～4℃冰箱內(nèi)備用。

（2）細(xì)胞準(zhǔn)備：收集3代以內(nèi)的耳軟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)備用。

（3）細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物制備：細(xì)胞懸液離心，棄去全部上清液，將濃縮的細(xì)胞團(tuán)打散，置于冰盒內(nèi)預(yù)冷5～10min。根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按5×107／ml的細(xì)胞濃度計(jì)算應(yīng)加入30%Pluronic－PBS凝膠毫升數(shù)，用已預(yù)冷的無(wú)菌注射器（帶刻度）吸取相應(yīng)量的Pluronic－PBS凝膠，加入上述含細(xì)胞的離心管內(nèi)，再置于冰盒內(nèi)繼續(xù)預(yù)冷5～10min，在振蕩器上將細(xì)胞與凝膠混合均勻，轉(zhuǎn)移到已預(yù)冷的無(wú)菌注射器中。注射前將細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物置于室溫或操作者手掌內(nèi)3～5min，復(fù)合物形成不流動(dòng)的凝膠狀時(shí)即可進(jìn)行皮下注射。

（4）皮下注射：動(dòng)物麻醉（豬以氯氨酮10～20mg／kg肌注麻醉，裸鼠以乙醚麻醉）成功后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求將細(xì)胞－Pluronic凝膠注射到相應(yīng)的動(dòng)物皮下并做好注射部位標(biāo)記。豬自體注射時(shí)一般選腹股溝區(qū)操作及隨訪觀察較為方便（因此處皮膚薄，皮下組織也相對(duì)較少），裸鼠皮下注射時(shí)一般選背部較為方便。注射過(guò)程中及注射后均可根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求對(duì)已注射到皮下的細(xì)胞－凝膠復(fù)合物進(jìn)行一定的預(yù)塑形。

2．當(dāng)所用生物材料為固體（如殼聚糖／明膠、PGA等）時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要先將支架材料預(yù)制成各種形狀，消毒后備用。支架材料在接種細(xì)胞前最好先進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)并初步測(cè)定其吸水能力，以避免材料污染并確定每塊支架材料能接種細(xì)胞懸液的最大體積。通常情況下，細(xì)胞－材料復(fù)合物中軟骨細(xì)胞的最終密度為（4～5）×107／mm3。接種時(shí)可根據(jù)支架材料的體積及這一細(xì)胞密度確定每塊材料所需的細(xì)胞量。下面以PGA支架為例介紹具體操作步驟如下。

（1）材料準(zhǔn)備：將PGA纖維預(yù)制成片狀、圓柱狀等各種需要的形狀，對(duì)于較為精確而復(fù)雜的形狀可滴加少量1．5%的聚乳酸（PLA）二氯甲烷溶液以固定支架形狀。制備好的材料支架浸于75%乙醇（V／V）中消毒30min～1h，PBS反復(fù)沖洗3次后，加入含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)24h后備用。

（2）細(xì)胞準(zhǔn)備：收集3代以內(nèi)的耳軟骨細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。細(xì)胞懸液離心，棄去上清液，將濃縮的細(xì)胞團(tuán)打散，根據(jù)支架材料體積、吸水能力測(cè)定結(jié)果及要接種的最終細(xì)胞密度，加入適量的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，一般應(yīng)達(dá)到（5～6）×107／ml。

（3）細(xì)胞－PGA復(fù)合物制備：盡量吸除材料支架內(nèi)的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至另一新的培養(yǎng)皿內(nèi)。將上述高濃度的細(xì)胞懸液振蕩混勻后，均勻地滴加到材料支架上，滴加細(xì)胞懸液的最大體積不能超過(guò)材料支架的最初總體積。

（4）復(fù)合物體外培養(yǎng)與觀察：將制備好的細(xì)胞－PGA復(fù)合物置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4～5h，待細(xì)胞充分黏附于PGA纖維后，加入含10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中注意觀察細(xì)胞與材料的黏附情況及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況?；盍α己玫亩浌羌?xì)胞在培養(yǎng)4～5h后能全部黏附于PGA纖維支架上，24～48h時(shí)已出現(xiàn)明顯的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，細(xì)胞可形成膜片，邊緣處可見(jiàn)細(xì)胞呈蛛網(wǎng)狀包裹PGA纖維，支架內(nèi)部因大量細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)存在而變得不透明。體外培養(yǎng)1周后，即可植入皮下進(jìn)行體內(nèi)軟骨構(gòu)建。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，軟骨?xì)胞－PGA復(fù)合物也可以在體外進(jìn)行軟骨構(gòu)建，經(jīng)過(guò)8～10周的體外培養(yǎng)，復(fù)合物在體外可形成良好的軟骨組織。

（5）皮下植入時(shí)間選擇：PGA纖維植入豬皮下可引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，所以豬自體的皮下植入實(shí)驗(yàn)應(yīng)在體外軟骨基本形成，PGA纖維已大部分降解后才能進(jìn)行。PGA纖維植入裸鼠皮下不引起明顯的炎癥反應(yīng)，所以，裸鼠皮下植入實(shí)驗(yàn)在體外復(fù)合物形成后的任何時(shí)間均可進(jìn)行。一般是在體外培養(yǎng)1周后進(jìn)行，此時(shí)軟骨細(xì)胞已充分黏附于PGA纖維并已有一定量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，有利于體內(nèi)軟骨形成。

（6）裸鼠皮下植入：裸鼠以乙醚麻醉，75%乙醇消毒背部皮膚。一般取背部橫切口，皮下鈍性分離形成皮下間隙，植入軟骨細(xì)胞－PGA復(fù)合物或體外培養(yǎng)的類軟骨樣組織，切口仔細(xì)縫合。

（7）豬自體皮下植入：麻醉（豬麻醉方法參見(jiàn)本章第一節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型建立）成功后，手術(shù)部位（一般選擇腹股溝區(qū)或側(cè)腹部）備皮、消毒、鋪無(wú)菌巾。切開(kāi)皮膚深達(dá)皮下組織，在皮下組織淺層鈍性分離形成皮下間隙，結(jié)扎明顯的出血點(diǎn)后，植入體外培養(yǎng)的類軟骨樣組織，切口仔細(xì)縫合。術(shù)后肌注青、鏈霉素抗感染治療3～5d。

（五）新生軟骨取材與相關(guān)檢測(cè)

1．皮下軟骨取材時(shí)間　皮下環(huán)境中組織工程化軟骨形成時(shí)間一般為6～10周。軟骨細(xì)胞與可注射性材料組成的復(fù)合物植入體內(nèi)6周時(shí)已能形成成熟的軟骨樣組織。細(xì)胞與固體支架材料組成的復(fù)合物植入體內(nèi)后形成軟骨的時(shí)間不同材料有所差異，主要與材料本身的降解時(shí)間及體外培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。如PGA纖維在皮下組織中的降解時(shí)間約6～8周，所以皮下成熟軟骨形成的時(shí)間也在8周左右。但如果體外培養(yǎng)時(shí)已形成了接近成熟的軟骨樣組織，則在體內(nèi)的軟骨成熟過(guò)程會(huì)明顯加快。

2．組織工程化軟骨的檢測(cè)與評(píng)價(jià)指標(biāo)

對(duì)皮下新生軟骨的檢測(cè)與評(píng)價(jià)主要包括大體觀察、軟骨體積與濕重、組織學(xué)檢測(cè)、生物力學(xué)檢測(cè)及軟骨特異性基質(zhì)含量的定量半定量檢測(cè)等，具體方法參見(jiàn)本章第三節(jié)組織工程化軟骨檢測(cè)技術(shù)。

（六）皮下軟骨構(gòu)建實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

1．軟骨細(xì)胞的功能和數(shù)量是決定組織工程化軟骨能否形成的兩個(gè)最重要影響因素?；盍^差或多次傳代的軟骨細(xì)胞很難在體內(nèi)形成軟骨組織，即使是活力和功能均良好的軟骨細(xì)胞，如果細(xì)胞接種濃度低于1．0 ×107／ml也不能在體內(nèi)形成良好的軟骨。因此，在進(jìn)行軟骨構(gòu)建時(shí)，必須同時(shí)兼顧軟骨細(xì)胞的功能及數(shù)量。

2．制備細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物時(shí)，所用的物品均須預(yù)冷處理，復(fù)合物混合的操作過(guò)程最好在4℃冷藏室內(nèi)進(jìn)行，使Pluronic凝膠處于液體狀態(tài)，確保其能與細(xì)胞充分混勻。

3．皮下注射時(shí)，應(yīng)先將細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物置于室溫或操作者手掌內(nèi)預(yù)熱3～5min，使復(fù)合物形成不流動(dòng)的凝膠狀再進(jìn)行注射，這樣可保證細(xì)胞高濃度集中在注射的局部區(qū)域。

二、透明軟骨構(gòu)建方法

透明軟骨在人體內(nèi)主要分布于關(guān)節(jié)表面、肋軟骨、氣管、鼻軟骨等處，組織工程研究最多的是關(guān)節(jié)軟骨，因此，這里簡(jiǎn)單介紹一下以關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的一般操作過(guò)程。

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

本章第一節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型建立中已提及，豬的膝關(guān)節(jié)在結(jié)構(gòu)、功能及軟骨厚度上與人非常接近，是良好的關(guān)節(jié)軟骨缺損研究模型。因此這里仍以豬膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型為例介紹關(guān)節(jié)透明軟骨構(gòu)建方法及關(guān)節(jié)缺損組織工程技術(shù)修復(fù)的一般過(guò)程。

（二）關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增

操作方法及注意事項(xiàng)同第4章第三節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，一般取3代以內(nèi)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行關(guān)節(jié)缺損修復(fù)研究。

（三）生物支架材料的選擇

常用的關(guān)節(jié)軟骨構(gòu)建生物支架材料包括膠原、纖維蛋白凝膠、殼聚糖／明膠膜、PGA、PLA包埋的PGA支架、聚羥基乙酸－聚乳酸共聚物（PLGA）等。本節(jié)以PLA包埋的PGA支架為例做一簡(jiǎn)單介紹。

（四）細(xì)胞－材料復(fù)合物制備

1．PGA／PLA材料支架制備　將非編織的PGA纖維稱量約30mg／份，均勻地嵌入已制備好的直徑8mm、高5mm的圓柱形硅橡膠模具內(nèi)（模具大小與軟骨缺損模型大小基本一致），加入1．5%的PLA液（以二氯甲烷為溶劑）0．3ml，待其自然干燥后取出真空保存?zhèn)溆谩?yīng)用時(shí)將制備好的材料支架浸于75%乙醇（V／V）中消毒30min～1h，PBS反復(fù)沖洗3次后，加入含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)24h后備用。

2．關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞準(zhǔn)備　細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法前已述及，實(shí)驗(yàn)時(shí)將體外培養(yǎng)3代以內(nèi)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞消化、收集、計(jì)數(shù)備用（如細(xì)胞量充足，也可直接應(yīng)用原代消化收集的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞）。應(yīng)用時(shí)細(xì)胞懸液離心，棄去上清液，濃縮的細(xì)胞團(tuán)打散，根據(jù)材料支架體積、吸水能力測(cè)定結(jié)果及要接種的最終細(xì)胞密度，加入適量的培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，一般應(yīng)達(dá)到（5～6）×107／ml。

3．細(xì)胞接種　盡量吸除材料支架內(nèi)的培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至另一新的6孔板內(nèi)。將上述高濃度的細(xì)胞懸液振蕩混勻后，均勻地滴加到材料支架內(nèi)部，滴加細(xì)胞懸液的最大體積一般不超過(guò)材料支架的最初總體積（約0．25ml）。

（五）復(fù)合物體外培養(yǎng)與觀察

將制備好的細(xì)胞－PGA／PLA復(fù)合物置于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)4～5h。如果應(yīng)用的細(xì)胞為原代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，因細(xì)胞黏附較慢，培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)延長(zhǎng)至6h以上。待細(xì)胞充分黏附于PGA纖維后，再加入含10%FBS的DMEM常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中注意觀察細(xì)胞與材料的黏附情況及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況?；盍α己玫年P(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在培養(yǎng)4～5h后均能良好地黏附于PGA纖維上，24～48h時(shí)可見(jiàn)到明顯的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞也可以形成膜片并呈蛛網(wǎng)狀包裹PGA纖維，支架內(nèi)部因大量細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)存在而不透明。同期培養(yǎng)單純PGA／PLA材料支架作為對(duì)照。

（六）皮下植入時(shí)間選擇

PGA纖維在豬關(guān)節(jié)缺損一般不會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，所以復(fù)合物植入體內(nèi)修復(fù)缺損的時(shí)間沒(méi)有嚴(yán)格的限制，甚至不經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的細(xì)胞材料復(fù)合物也可以直接用軟骨缺損的修復(fù)。多數(shù)研究?jī)A向于體外培養(yǎng)1周后再進(jìn)行體內(nèi)缺損修復(fù)，此時(shí)細(xì)胞已充分黏附于PGA纖維并已有一定量的細(xì)胞外基質(zhì)分泌，有利于體內(nèi)軟骨形成。

（七）復(fù)合物體內(nèi)植入修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損

動(dòng)物麻醉及關(guān)節(jié)軟骨缺損制造方法和操作過(guò)程可參見(jiàn)本章第一節(jié)軟骨缺損動(dòng)物模型建立。一般可在每個(gè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)外側(cè)髁各做1個(gè)缺損，雙側(cè)共4個(gè)缺損，實(shí)驗(yàn)組用細(xì)胞－材料復(fù)合物修復(fù)，對(duì)照組可用單純材料支架修復(fù)或空白不修復(fù)。術(shù)后肌注青、鏈霉素抗感染治療3～5d。

（八）關(guān)節(jié)缺損修復(fù)結(jié)果評(píng)價(jià)與相關(guān)檢測(cè)

1．關(guān)節(jié)缺損修復(fù)取材時(shí)間　大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)觀察的時(shí)間點(diǎn)一般應(yīng)包括術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月及1年以上。3個(gè)月時(shí)主要觀察缺損修復(fù)的早期情況，包括缺損修復(fù)的充盈度，新生組織的成熟程度及軟骨下松質(zhì)骨的修復(fù)情況。6個(gè)月時(shí)主要觀察缺損內(nèi)修復(fù)組織的改建與重塑，組織學(xué)特征，生物力學(xué)特性及生化組成。1年以上時(shí)取材，主要觀察修復(fù)的遠(yuǎn)期效果及修復(fù)的關(guān)節(jié)表面軟骨是否會(huì)發(fā)生骨化。

2．組織工程技術(shù)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的檢測(cè)與評(píng)價(jià)指標(biāo)　對(duì)關(guān)節(jié)缺損修復(fù)的檢測(cè)與評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括大體觀察、組織學(xué)檢查、生物力學(xué)檢測(cè)及軟骨特異性基質(zhì)含量的定量半定量檢測(cè)等。此外，還可根據(jù)大體觀察與組織學(xué)檢查結(jié)果，對(duì)修復(fù)結(jié)果進(jìn)行分級(jí)評(píng)價(jià)（表10－2）。具體方法參見(jiàn)本章第三節(jié)組織工程化軟骨檢測(cè)技術(shù)。

表10－2　關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)大體觀察與組織學(xué)檢查分級(jí)

（九）關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

1．為進(jìn)行科學(xué)的療效評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組缺損的位置必須對(duì)稱，缺損的大小、深度也盡量一致，以保證局部微環(huán)境和機(jī)械負(fù)荷對(duì)缺損修復(fù)的影響在各處理組間的均衡。

2．植入細(xì)胞－支架復(fù)合物或單純支架材料時(shí)，最好用可吸收縫線“十字”交叉縫合固定以免植入物脫落。

3．關(guān)節(jié)內(nèi)無(wú)血供，抗感染能力低，易化膿形成關(guān)節(jié)內(nèi)積液而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。手術(shù)時(shí)必須嚴(yán)格無(wú)菌操作，術(shù)后分層認(rèn)真縫合。其他同皮下軟骨構(gòu)建。

三、纖維軟骨構(gòu)建方法

纖維軟骨在人體內(nèi)主要分布于半月板、椎間盤(pán)等處，纖維軟骨組織構(gòu)建在組織工程研究相對(duì)較少，這里簡(jiǎn)單介紹一下以半月板纖維軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞修復(fù)膝關(guān)節(jié)半月板纖維軟骨缺損的主要操作過(guò)程。

（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

前面第4章第三節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中已介紹了豬半月板軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)及擴(kuò)增方法，豬的半月板在結(jié)構(gòu)、功能等諸多方面也與人非常接近，是良好的纖維軟骨缺損研究模型。因此這里以豬膝關(guān)節(jié)半月板軟骨缺損模型為例，介紹纖維軟骨構(gòu)建方法及半月板缺損組織工程技術(shù)修復(fù)的一般過(guò)程。

（二）纖維軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增

操作方法及注意事項(xiàng)同第4章第三節(jié)半月板軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)。在常規(guī)培養(yǎng)條件下，一般以3代以內(nèi)的半月板軟骨細(xì)胞進(jìn)行缺損修復(fù)研究。

（三）生物支架材料的選擇

因半月板缺損修復(fù)研究相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)僅嘗試了Pluronic與PGA相結(jié)合作為材料支架的修復(fù)方法，因此，我們就以這一支架材料為例進(jìn)行介紹。

（四）細(xì)胞－材料復(fù)合物制備

1．PGA材料支架制備　將非編織的PGA纖維稱量約15mg／份，手工制成8mm ×10mm厚度均勻的片狀支架。應(yīng)用時(shí)將制備好的材料支架浸于75%乙醇（V／V）中消毒30min～1h，PBS反復(fù)沖洗3次，在含10%FBS的DMEM中培養(yǎng)24h后備用。30%的Pluronic　F－127配制方法同彈性軟骨構(gòu)建。

2．纖維軟骨細(xì)胞準(zhǔn)備　半月板細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法參見(jiàn)第4章第三節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將體外培養(yǎng)3代以內(nèi)的半月板纖維軟骨細(xì)胞消化、收集、計(jì)數(shù)備用。

3．細(xì)胞－生物材料復(fù)合物形成　①細(xì)胞懸液離心，棄去全部上清液，濃縮的細(xì)胞團(tuán)打散，置于冰盒內(nèi)預(yù)冷5～10min；②根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，按3．5×107／ml的細(xì)胞濃度計(jì)算應(yīng)加入30%的Pluronic－PBS凝膠毫升數(shù)，用已預(yù)冷的無(wú)菌注射器（帶刻度）吸取相應(yīng)量的Pluronic－PBS凝膠，加入上述含細(xì)胞的離心管內(nèi)，再置于冰盒內(nèi)繼續(xù)預(yù)冷5～10min；③在振蕩器上將細(xì)胞與Pluronic凝膠混合均勻，形成細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物，將復(fù)合物吸入注射器置于冰盒內(nèi)備用；④吸除PGA纖維支架內(nèi)的培養(yǎng)液，置于冰盒內(nèi)預(yù)冷5～10min后，將細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物均勻地滴加到PGA纖維支架內(nèi)，形成細(xì)胞－Pluronic－PGA復(fù)合物，常溫?zé)o菌條件下備用。

（五）復(fù)合物體內(nèi)植入修復(fù)半月板軟骨缺損

1．缺損模型的制備　動(dòng)物麻醉方法同關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)。麻醉平穩(wěn)后，動(dòng)物后肢膝關(guān)節(jié)備皮，常規(guī)消毒鋪無(wú)菌巾，手術(shù)肢體膝關(guān)節(jié)以下用無(wú)菌巾包裹。膝關(guān)節(jié)屈曲90°位，在髕韌帶內(nèi)緣與髕骨下極的交點(diǎn)向內(nèi)旁開(kāi)0．5cm為起點(diǎn)由內(nèi)下方行略突向外下的斜弧形切口約3～4cm，分離皮下組織和淺筋膜，旁開(kāi)髕韌帶內(nèi)緣0．5cm縱形切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，暴露內(nèi)側(cè)半月板前半部，切斷其附著于脛骨平臺(tái)邊緣的冠狀韌帶，保留半月板前角，于內(nèi)側(cè)副韌帶前方的半月板周圍面做間隔1cm長(zhǎng)的一對(duì)刻痕；以拉鉤保護(hù)內(nèi)側(cè)副韌帶，切去刻痕間的全層半月板。

2．缺損的修復(fù)　用4－0可吸收縫線將一張2．5cm×3．5cm多孔生物膜橋接并包繞縫合兩斷端，于斷端間填入PGA－細(xì)胞－Pluronic復(fù)合物，對(duì)照組以無(wú)細(xì)胞的Pluronic－PGA支架修復(fù)或曠置缺損。生物膜對(duì)合后一并固定于脛骨平臺(tái)邊緣，即修復(fù)冠狀韌帶。徹底止血后，仔細(xì)修復(fù)關(guān)節(jié)囊，分層關(guān)閉切口。待動(dòng)物蘇醒送回動(dòng)物飼養(yǎng)房，不限制其籠內(nèi)活動(dòng)。術(shù)后常規(guī)肌注青、鏈霉素抗感染治療3～5d。

（六）半月板缺損修復(fù)結(jié)果評(píng)價(jià)與相關(guān)檢測(cè)

1．半月板缺損修復(fù)取材時(shí)間　一般于術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月及9個(gè)月時(shí)取材。3個(gè)月時(shí)主要觀察缺損修復(fù)的早期情況，包括缺損修復(fù)的充盈度，新生組織的成熟程度及其與周圍正常組織交界處的修復(fù)情況等。6個(gè)月時(shí)主要觀察缺損內(nèi)修復(fù)組織的改建與重塑，組織學(xué)特征，生物力學(xué)特性及生化組成。9個(gè)月時(shí)主要觀察缺損修復(fù)的中遠(yuǎn)期效果。

2．組織工程技術(shù)修復(fù)半月板軟骨缺損的檢測(cè)與評(píng)價(jià)指標(biāo)　與關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)類似，主要的檢測(cè)與評(píng)價(jià)指標(biāo)包括大體觀察、組織學(xué)檢查、生物力學(xué)檢測(cè)及軟骨特異性基質(zhì)含量的定量半定量檢測(cè)等。具體方法參見(jiàn)本章第三節(jié)組織工程化軟骨檢測(cè)技術(shù)。

（七）半月板軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)

基本與皮下軟骨構(gòu)建及關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)相同。除注意調(diào)整好細(xì)胞活力及接種數(shù)量外，手術(shù)過(guò)程中更應(yīng)注意無(wú)菌操作并盡量減少創(chuàng)傷，有效恢復(fù)正常關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，防止術(shù)后關(guān)節(jié)內(nèi)粘連。