體內(nèi)植入成骨實驗是檢驗骨組織工程技術(shù)的金標準，體內(nèi)植入實驗從構(gòu)建的目的方式上分為異位構(gòu)建和原位構(gòu)建。異位構(gòu)建的目的是通過在肌肉內(nèi)或皮下等非骨缺損部位植入細胞材料復(fù)合物，通過局部豐富的血循環(huán)營養(yǎng)種子細胞，促進組織工程骨的形成。異位構(gòu)建在骨組織工程最初的發(fā)展過程中作為證明這一技術(shù)的可行性起到了重要的作用，但這種形式畢竟不是修復(fù)骨缺損，所以隨著骨組織工程技術(shù)的發(fā)展，原位構(gòu)建的模式逐漸占據(jù)了主導(dǎo)地位。原位構(gòu)建因為是直接修復(fù)骨缺損，所以實驗結(jié)果更有說服力。但原位構(gòu)建的不利之處在于往往骨缺損區(qū)域的局部血循環(huán)較差，所以又涉及到促進組織工程骨再血管化的問題，在各種促血管化的手段中預(yù)構(gòu)骨瓣這一異位方式又作為一種新手段登臺了。

一、異位構(gòu)建組織工程骨

（一）動物皮下或肌肉內(nèi)異位構(gòu)建組織工程骨

體內(nèi)植入異位構(gòu)建實驗研究和臨床初步應(yīng)用研究骨和軟骨組織工程是研究最早、最深入，也是目前發(fā)展最快的組織工程內(nèi)容。

Nakahara將原代體外培養(yǎng)的骨膜源性細胞注入無胸腺小鼠的皮下，結(jié)果在該處產(chǎn)生了骨組織。由于單純的、游離的成骨細胞在移植過程中易丟失，影響其成骨能力，Nakahara又將來源于出生7d的白色萊亨雞脛骨骨膜培養(yǎng)的細胞與多孔性羥基磷灰石（剪成約3mm3的立方體）結(jié)合，再將該復(fù)合物移植到無胸腺小鼠體內(nèi)檢測其成骨能力。移植后第10天，就可在孔周圍觀察到編織骨的形成，而在孔的中央，可見大量軟骨細胞，周圍環(huán)繞著豐富的細胞間基質(zhì)。14d時孔周已充滿骨組織，孔的深部軟骨已被侵入的血管和通過軟骨內(nèi)骨化的骨所取代。Nolan將脫鈣骨基質(zhì)與成骨細胞一同培養(yǎng)，也觀察到成骨細胞不僅覆蓋骨基質(zhì)表面，而且長入骨基質(zhì)間隙中，認為這種含成骨細胞的復(fù)合物是一種良好的骨移植代替物。Lang等從新生小鼠中分離培養(yǎng)成骨細胞，與羥基磷灰石、明膠復(fù)合后植入同種系小鼠內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能明顯提高新的骨組織構(gòu)建。Noshi等將BMSC／HA／BMP復(fù)合物植入大鼠皮下，2周時就發(fā)現(xiàn)有明顯的骨組織形成，同時堿性磷酸酶與骨鈣素在蛋白和基因水平上均有較高水平的表達，表現(xiàn)廣泛的成骨活動，4周及8周時新生骨組織的量大大增加。BMSC／HA復(fù)合物移植組2周時未檢測到新生骨組織，4周時有中等量的骨組織形成，8周時骨組織形成明顯增多。而單用HA或BMP／HA復(fù)合物的對照組移植后始終未檢測到新生骨組織。

原位皮下或肌肉內(nèi)的組織工程骨的異位構(gòu)建在骨組織工程技術(shù)出現(xiàn)的初始階段以其操作簡單，結(jié)果較為肯定，可重復(fù)性強等優(yōu)勢成為主要的驗證這一技術(shù)的手段。之后由于基因工程等最新技術(shù)與組織工程技術(shù)的迅速結(jié)合，尤其是對種子細胞的改性的研究成為一個熱點，作為一種簡便易行的實驗手段這種異位構(gòu)建模式仍然有一定的價值。

（二）預(yù)構(gòu)骨瓣的研究

眾所周知，帶有血運的骨移植比傳統(tǒng)的骨移植修復(fù)骨缺損具有明顯的優(yōu)勢。不帶血運的骨移植只有誘導(dǎo)成骨作用，使移植骨的吸收和新骨生成同時發(fā)生，只能起到“同步取代”的作用。而帶血管蒂的骨瓣移植，可以完整的對合兩端填補在骨缺損處（如吻合血管腓骨移植修復(fù)股骨缺損），帶血管蒂的骨瓣移植由于保證了骨的主要血液供應(yīng)，移植后骨細胞及成骨細胞等組織細胞全部存活或大部分存活，其愈合過程類似于雙極骨折（bifocal fracture）的愈合過程。這種修復(fù)是快捷的，已成為共識。受此啟發(fā)，在組織工程骨的構(gòu)建過程中為能達到帶血管蒂的組織工程骨的局部轉(zhuǎn)移或吻合血管游離移植修復(fù)骨缺損，學(xué)者們開始嘗試將生物材料細胞復(fù)合體預(yù)先置于各種帶蒂的筋膜瓣及肌瓣中，待其完成成骨及再血管化過程后再行移植。

1．概念　預(yù)構(gòu)皮瓣就是將知名血管或含知名血管的筋膜、肌肉等組織移植到所需部位的某一層次，或?qū)⑵て浦灿诤兄苁慕M織上（包括筋膜、大網(wǎng)膜）等，通過一段時間重新血管化而形成軸型皮瓣，在二期移位時攜帶下方的組織一并轉(zhuǎn)移。而預(yù)構(gòu)骨瓣就是用預(yù)構(gòu)皮瓣攜帶并滋養(yǎng)骨塊（圖9－7）。

圖9－7　猴背闊肌預(yù)構(gòu)骨瓣

2．預(yù)構(gòu)皮瓣的實驗研究　Diller等（1966）證明狗的含血管回腸片段能維持預(yù)構(gòu)皮瓣及皮下組織成活，同時提出了預(yù)構(gòu)的概念。Washio（1971）預(yù)構(gòu)以狗剝除黏膜的小腸片段攜帶腹壁組織移植成活，也確認了預(yù)構(gòu)的理論。Erol（1976），將游離皮片直接移植于狗的股動、靜脈表面，并形成局部皮瓣移位獲得成功。Erk等（1983）應(yīng)用同樣技術(shù)植入皮瓣下軸心血管，擴大皮瓣和肌皮瓣的應(yīng)用面積。Stal（1983）、Durate等（1987）應(yīng)用軸型血管移位預(yù)構(gòu)帶有骨及軟骨的皮瓣。通過這些不斷的探索與研究，將軸心血管植入到所需供區(qū)而創(chuàng)造了新的軸型皮瓣供區(qū)（也就是將原隨意型皮瓣供區(qū)改建成軸型皮瓣供區(qū)）。植入到新的軸型皮瓣供區(qū)的可以是腸系膜血管蒂、單純血管束、筋膜血管蒂或肌血管蒂。

3．預(yù)構(gòu)骨瓣在骨組織工程中的應(yīng)用為了加速周圍血管長入植入的組織工程骨組織，促進與宿主骨之間的融合，Casabona等設(shè)計出一種生物工程化預(yù)構(gòu)骨肌瓣，即帶血管蒂的組織工程骨，將經(jīng)培養(yǎng)2周的人BMSC以2×105與羥基磷灰石復(fù)合后，植入裸鼠預(yù)先制備的帶血管蒂的背闊肌瓣中，8周后組織學(xué)檢查顯示“預(yù)構(gòu)工程化骨肌瓣”中有豐富的骨組織形成，血運豐富，細胞和材料復(fù)合體與肌瓣間形成良好的接觸界面，形成工程化的帶血管蒂的骨肌瓣，隨后進行的帶蒂骨組織移植修復(fù)骨缺損的效果良好。這使組織工程化新生骨組織完全替代自體骨移植成為可能，并為組織工程化新生骨組織的體內(nèi)植入提供借鑒。Mankani等從轉(zhuǎn)基因小鼠的長骨中收集BMSC并經(jīng)培養(yǎng)擴增后，移植于裸鼠的頸總動脈、頸內(nèi)靜脈、主動脈及其伴行靜脈等周圍，對照組未植入BMSC細胞，術(shù)后4周至2年取材行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、血管造影分析。結(jié)果表明，治療組86．5%（32／37）有血管化的骨島形成，其血運由特定的頸總動脈分支單獨支配，而對照組沒有血管化的骨島形成。成熟的血管化骨島由發(fā)育良好的薄層皮質(zhì)骨及松質(zhì)骨構(gòu)成，其成骨細胞來源于移植的BMSC，而造血組織來源于受體鼠。血管化骨島早在術(shù)后4周就開始形成，隨著時間的推移不斷擴大，一直持續(xù)到108周。這說明鼠的BMSC可用來形成血管化的帶蒂骨瓣，這些帶蒂骨瓣可通過顯微外科技術(shù)植入受體相應(yīng)部位。

二、組織工程骨組織的原位構(gòu)建

與其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究一樣，組織工程骨在內(nèi)的原位構(gòu)建也是經(jīng)歷了從小動物體到大動物直至人體試驗。這是一個循序漸進的過程，每一個階段都出現(xiàn)了很多經(jīng)典的實驗，為進一步的研究奠定了扎實的基礎(chǔ)。

（一）組織工程骨在小動物體內(nèi)的原位構(gòu)建

Vacanti等用種植有成骨細胞或軟骨細胞的聚合物對裸鼠顱骨缺損進行修復(fù)，設(shè)立對照，結(jié)果成骨細胞移植組缺損部有軟骨和骨生長，而對照組無生長。Vacanti等還利用骨膜成骨細胞和聚合物支架復(fù)合移植制成帶血管蒂的新生骨組織。隨后Cao等的研究中采用顯微外科技術(shù)將帶血管蒂的新生骨組織植入修復(fù)股骨缺損，發(fā)現(xiàn)移植骨成活并有良好的愈合界面。Beck等在修復(fù)兔橈骨1．5cm骨缺損的實驗中，以磷酸三鈣和羥乙基淀粉作為TGFβ1的載體，采用TGFβ1／BMSC／載體復(fù)合物修復(fù)骨缺損，結(jié)果顯示其成骨能力與自體骨移植相似，其成骨量、骨缺損修復(fù)處的機械強度與所形成的主要板層骨的組織學(xué)結(jié)構(gòu)均明顯優(yōu)于TGFβ1／載體復(fù)合組及空白對照組。Breiybart等用骨膜細胞與PGA材料復(fù)合，修復(fù)兔顱骨直徑為15mm的缺損，對新生組織進行組織學(xué)、生物化學(xué)及放射線檢查，發(fā)現(xiàn)在新骨形成的各個階段，組織工程化新生骨組織的骨含量、膠原含量及放射線密度均大于對照組，12周時骨缺損處基本被新生骨組織填充。Bruder等將多孔陶瓷負載培養(yǎng)擴增的人BMSC植入無胸腺兔一側(cè)脛骨缺損處，對側(cè)單用多孔陶瓷載體作對照，負載BMSC的實驗側(cè)術(shù)后8周有新骨形成，12周時生物力學(xué)測試實驗側(cè)修復(fù)的脛骨強度遠遠大于對照側(cè)。Shang等將成年羊制成直徑為20mm的雙側(cè)頂骨全厚骨缺損，實驗側(cè)采用自體培養(yǎng)擴增的BMSC復(fù)合藻酸鈣修復(fù)，對照側(cè)單用藻酸鈣及空白對照。術(shù)后6周實驗組可檢測到新骨形成，18周時新生的組織工程骨組織更為成熟，三維CT掃描顯示實驗組骨缺損幾乎完全修復(fù)。Isogai等用新鮮牛骨膜包饒PLA和PGA形成的聚合指骨體，又在PGA聚合片中種植軟骨細胞和腱細胞，體外縫合裝配形成含遠節(jié)指骨、中節(jié)指骨和指間關(guān)節(jié)的模型。并將此模型植入去胸腺小鼠的皮下，20周后形成了具有人指骨及指間關(guān)節(jié)形狀的三維結(jié)構(gòu)。組織學(xué)檢查顯示有成熟的關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨和腱帽，結(jié)構(gòu)與人指骨及關(guān)節(jié)極其相似。說明用組織工程方法可構(gòu)建復(fù)雜的骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)。

（二）組織工程骨在大動物體內(nèi)的原位構(gòu)建

戴克戎利用腺病毒介導(dǎo)的人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Adv　hBMP　2）基因轉(zhuǎn)染的組織工程化人工骨對羊脛骨干骨缺損模型（2．6cm）修復(fù)，結(jié)果證明hBMP　2基因修飾的組織工程化人工骨可以修復(fù)羊脛骨的節(jié)段性缺損。陽富春于獼猴脛骨結(jié)節(jié)抽取MSCs并使誘導(dǎo)分化為成骨樣細胞，用5－溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）標記，培養(yǎng)后與人源生物衍生骨材料體外復(fù)合構(gòu)成組織工程化骨，植入15只異體獼猴修復(fù)橈骨2．5cm長段骨缺損作為實驗組；用單純生物衍生骨材料修復(fù)對側(cè)同樣骨缺損作為對照組；另取2只獼猴雙側(cè)橈骨同樣部位和大小骨缺損曠置作為空白組。結(jié)果顯示實驗組和對照組術(shù)后1、2和3周移植物周圍組織反應(yīng)較明顯，6周后明顯減輕，12周時基本消失。實驗組標記成骨樣細胞于術(shù)后6周仍存在，術(shù)后12周基本消失；骨缺損部位骨樣組織、軟骨、編織骨和板層骨出現(xiàn)時間均較對照組早，且骨愈合時間提前3～6周。實驗組骨缺損以多點方式直接成骨，對照組則從兩端以“爬行替代”方式成骨?？瞻捉M術(shù)后12周骨缺損均無愈合。

骨組織工程動物實驗中骨缺損模型有多種。按骨缺損的類型分洞缺性骨缺損和段缺性骨缺損，前者有長骨、扁骨和不規(guī)則骨的骨與骨膜缺損，后者是長骨的骨與骨膜缺損；按動物體積分：羊、狗、豬是常用的大動物，鼠、兔是常用的小動物。鼠、兔的顱骨洞缺性骨缺損模型與兔尺、橈骨段缺性骨缺損模型在臨床前動物實驗中是最常用的。狗、豬的下頜骨或股骨洞缺性骨缺損模型可以在一側(cè)骨上做多個缺損模型，以上模型均可以用大樣本實驗，易于統(tǒng)計分析，骨缺損部位不需內(nèi)固定，簡化了實驗操作，減少了影響因素與誤差。以上模型仍難滿足臨床實驗要求，具體表現(xiàn)為成骨量少、與臨床實際不相符。臨床發(fā)生率較高骨缺損是負重或應(yīng)力集中部位的管狀骨的大段段缺性骨缺損，多由創(chuàng)傷、感染造成，治療難度大。近期發(fā)展起來的骨組織工程是將自體種子細胞體外擴增后與生物材料復(fù)合，植入骨缺損部位修復(fù)骨缺損，在理論上是該類型骨缺損修復(fù)的最理想治療模式。從臨床的角度出發(fā)，對骨組織工程修復(fù)該類型骨缺損的動物模型要求：①骨缺損量要大；②相似的軟組織與力學(xué)環(huán)境；③考慮內(nèi)外固定影響。目前一些骨組織工程研究對成骨量小的模型能得到比較理想的結(jié)果，在成骨量較大的模型上結(jié)果不理想，這是因為種子細胞體外培養(yǎng)的時間短，本身成骨潛能易于保持，如用于大量骨缺損修復(fù)，要求成骨量大，為達到一定數(shù)量，種子細胞的體外培養(yǎng)時間將增加，成骨能力會降低。洞缺性骨缺損與段缺性骨缺損的生物力學(xué)環(huán)境是不同的，段缺性骨缺損的軸向應(yīng)力會影響新骨的形成，而洞缺性骨缺損缺乏應(yīng)力的刺激。按目前技術(shù)，較大骨缺損修復(fù)后的固定仍必須依靠內(nèi)外固定，要考慮不同固定材料、方式與生物材料／種子細胞的相互影響。因此，大體動物長管狀骨的段缺性骨缺損模型是與臨床實際最相符合的模型。

（三）組織工程骨臨床的異位構(gòu)建

楊志明等采用組織工程肋骨成功治療了1例左胸壁巨大韌帶樣纖維瘤的女性患者。術(shù)前6周采用自體髂骨穿刺獲取骨髓，分離培養(yǎng)BMSC，經(jīng)誘導(dǎo)分化成骨樣細胞作為種子細胞，與經(jīng)去細胞、去抗原的生物衍生骨支架在體外聯(lián)合培養(yǎng)，構(gòu)建成3條長10cm的組織工程肋骨。術(shù)中在切除重達2　6kg腫瘤及被侵犯的肋骨之后，以3條組織工程肋骨重建肋骨支架，用同側(cè)腹部帶蒂皮瓣修復(fù)胸壁皮膚缺損。術(shù)后1年腫瘤無復(fù)發(fā)，心肺功能正常。Quarto等報道了3例分別為骨延長失敗所致的右脛骨中段4cm骨缺損、右尺骨遠段4cm創(chuàng)傷性缺損以及右肱骨粉碎性骨折所致7cm缺失病例，應(yīng)用自體骨髓基質(zhì)干細胞和羥基磷灰石構(gòu)建的組織工程骨修復(fù)，取得了成功。經(jīng)X線照片和CT掃描顯示，3例術(shù)后2個月沿植入組織工程骨都有豐富的骨痂形成，組織工程骨與宿主骨的界面也見很好骨整合。Vacanti等報道了1例創(chuàng)傷性左拇指遠側(cè)指骨、伸肌腱及背側(cè)皮膚撕脫傷用組織工程方法修復(fù)后的早、中期效果。傷指先用腹部帶蒂皮覆蓋，斷蒂后用自體左橈骨骨膜來源的成骨細胞經(jīng)培養(yǎng)擴增后和多孔珊瑚HA預(yù)制的指骨形植入物復(fù)合，再植入拇指皮瓣袋內(nèi)。修復(fù)后的拇指恢復(fù)了正常的長度、捏拿功能和一定的關(guān)節(jié)活動度。雖然植入10個月后的手術(shù)活檢顯示僅5%的植入物有新骨形成，術(shù)后28個月的隨訪X線照片檢查指間關(guān)節(jié)有狹窄，檢查拇指的捏壓力只有正常的25%，指間關(guān)節(jié)僅15°的被動活動度，但無疑顯示了組織工程構(gòu)建骨在臨床應(yīng)用的潛力。

骨組織工程技術(shù)的最終目的就是其在臨床上的廣泛的應(yīng)用，隨著組織工程基本技術(shù)的成熟及在動物體內(nèi)實驗的不斷成功，越來越多的研究者把目光投入到人體試驗中去。但是相關(guān)的試驗規(guī)范和法律法規(guī)的建設(shè)仍然需要加強。