一、角膜基質(zhì)重建

基質(zhì)是角膜重建過(guò)程中維持透明和機(jī)械強(qiáng)度的關(guān)鍵所在。人們可以利用人工合成材料或天然材料構(gòu)建角膜基質(zhì)。

（一）聚乳酸與聚羥基乙酸的共聚物（PLGA）作為構(gòu)建角膜基質(zhì)

將培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞接種到PLGA材料上，構(gòu)建成角膜基質(zhì)細(xì)胞－PLGA復(fù)合物（圖14－12，彩圖50）。掃描電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，角膜基質(zhì)細(xì)胞能與PLGA牢固地結(jié)合（圖14－13），并能在PLGA上增殖，材料對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。

（二）應(yīng)用膠原重建角膜基質(zhì)

圖14－12　角膜基質(zhì)細(xì)胞－PLGA復(fù)合物

圖14－13　角膜基質(zhì)細(xì)胞與PLGA牢固結(jié)合

混勻角膜基質(zhì)細(xì)胞和牛的Ⅰ型膠原，調(diào)節(jié)pH值到7．4，倒入帶有錨環(huán)的有蓋培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)1h使之凝膠化，基質(zhì)也可選用人的Ⅰ型和Ⅲ型膠原，錨定環(huán)被設(shè)定用來(lái)防止游離凝膠收縮。在培養(yǎng)過(guò)程中錨定環(huán)可以維持表面積穩(wěn)定；收縮現(xiàn)象只在軸向發(fā)生。錨定環(huán)限定于重建組織的邊緣，不會(huì)干擾細(xì)胞，而且使得后繼的處理和氣液界面培養(yǎng)更加方便。這種方法生產(chǎn)的凝膠中散布有成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)過(guò)程中，成纖維細(xì)胞重建細(xì)胞外基質(zhì)，為上皮細(xì)胞提供更好的基底。

（三）應(yīng)用膠原－硫酸軟骨素重建角膜基質(zhì)

1．緩沖液為0．5mol／L　NaOH，2．2g／L NaHCO3和47．7g／L　HEPES混勻。

2．在0．4ml的13．5g／LⅠ型膠原溶液和0．05mol的1g／L硫酸軟骨素溶液中，加入的10×DMEM和0．05ml的1×106／ml角膜基質(zhì)細(xì)胞液 ，置冰盒內(nèi)緩慢攪拌混勻 ，再加入0．05ml緩沖液及0．02%戊二醛交聯(lián)液0．05ml，置37℃下約30min，加甘氨酸中和，可重建成直徑為1cm，厚度為1mm的纖維板層結(jié)構(gòu)，加入2ml的DMEM培養(yǎng)液（含15%胎牛血清）。

上述構(gòu)建的角膜基質(zhì)在機(jī)械強(qiáng)度和超微結(jié)構(gòu)上與正常角膜基質(zhì)相去甚遠(yuǎn)，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的可能性很小，但是可以進(jìn)行體外的研究。筆者從1994年開始進(jìn)行異種角膜基質(zhì)免疫原性和移植后角膜神經(jīng)的恢復(fù)、植床的組織學(xué)變化、移植后不同時(shí)期角膜透明度、屈光度和厚度變化等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：異種角膜基質(zhì)的免疫原性很低，可以用于異種移植，移植后角膜基質(zhì)的厚度、屈光度保持不變，自體神經(jīng)可以長(zhǎng)入，角膜知覺(jué)大部分恢復(fù)，上皮細(xì)胞貼附牢固，細(xì)胞間和細(xì)胞基底膜間生理連接正常，培養(yǎng)的角膜上皮細(xì)胞在氣液界面可以在異種角膜基質(zhì)上形成復(fù)層。角膜基質(zhì)是良好的基底膜含有角膜細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，具有抑制角膜新生血管的作用，免疫原性低和誘導(dǎo)培養(yǎng)上皮細(xì)胞分化和確定極向的作用。因此可以認(rèn)為異種角膜基質(zhì)具有成為培養(yǎng)細(xì)胞載體，用于合成人工生物角膜的潛能。另外，合成、改性和篩選高分子合成材料制作角膜基質(zhì)也是目前重要的研究方向。

二、角膜上皮重建

目前上皮重建有多種方法可選，體外擴(kuò)增后接種于重建的基質(zhì)上，培養(yǎng)基換為上皮培養(yǎng)基，包含上皮生長(zhǎng)所需的各種成分，在這種條件下，上皮細(xì)胞可以整齊地黏附于基質(zhì)上，然后應(yīng)用氣－液界面培養(yǎng)，促進(jìn)上皮形成復(fù)層。應(yīng)用灌注培養(yǎng)器（圖14－14，彩圖51；圖14－15，彩圖52）或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)箱產(chǎn)生的氣液界面更加接近于體內(nèi)微環(huán)境。以膠原凝膠、軟性角膜接觸鏡及羊膜為載體構(gòu)建成上皮植

圖14－14　曲面灌注培養(yǎng)器

圖14－15　基本灌注培養(yǎng)器

片的研究均有報(bào)道，羊膜被認(rèn)為是工程化角膜上皮的最佳載體。目前，應(yīng)用羊膜為載體擴(kuò)增角膜緣干細(xì)胞，構(gòu)建工程化角膜上皮層治療眼表疾病已成為研究的熱點(diǎn)。但羊膜作為基底膜如何維持角膜緣干細(xì)胞的特性（圖14－16，彩圖53）、促進(jìn)上皮細(xì)胞遷移、黏附、分化及基底膜成分與黏附分子相互作用機(jī)制還不明確，需要進(jìn)一步研究探討。

圖14－16　羊膜在維持角膜緣干細(xì)胞的特性中的作用

Nishida報(bào)道應(yīng)用溫度－反應(yīng)培養(yǎng)皿培養(yǎng)角膜上皮復(fù)層，通過(guò)降低溫度上皮植片自動(dòng)脫落培養(yǎng)皿，無(wú)須載體就可以進(jìn)行眼表重建，構(gòu)建角膜也可以采用溫度－反應(yīng)培養(yǎng)皿，直接將擴(kuò)增的復(fù)層上皮接種于構(gòu)建好的基質(zhì)上，這將大大簡(jiǎn)化角膜構(gòu)建的程序，而且避免了載體的應(yīng)用，溫度敏感培養(yǎng)皿的發(fā)明，是組織工程技術(shù)上的重大突破，被稱為細(xì)胞植片工程（Cell　sheet　engineering），應(yīng)用這種技術(shù)，日本科學(xué)家構(gòu)建出類似肝臟、腎臟等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的組織。細(xì)胞植片移植技術(shù)使角膜上皮層的構(gòu)建擺脫了對(duì)于載體的依賴，這將極大地促進(jìn)組織工程化角膜的發(fā)展，為構(gòu)建組織工程化全層角膜帶來(lái)希望。

三、角膜內(nèi)皮重建

Descemet膜具有為角膜內(nèi)皮細(xì)胞載體的潛能。Bohnke等（1998，1999）成功地將人或豬角膜內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)在Descemet膜上，并進(jìn)行了移植試驗(yàn)。Minami，Zieske，Schneider等構(gòu)建角膜采用的也是動(dòng)物內(nèi)皮細(xì)胞，人的內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，應(yīng)用于構(gòu)建估計(jì)為時(shí)不遠(yuǎn)。Bowman膜結(jié)構(gòu)相對(duì)比較簡(jiǎn)單：由纖細(xì)的膠原纖維隨機(jī)排列組成，Descemet膜是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的精細(xì)結(jié)構(gòu)，重建角膜添加內(nèi)皮細(xì)胞以后Descemet膜可以形成。

四、動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)

（一）角膜基質(zhì)材料的生物相容性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)顯微手術(shù)將構(gòu)建的角膜基質(zhì)材料移植到兔或猴眼角膜基質(zhì)層間，利用光學(xué)顯微鏡、電鏡觀察細(xì)胞與基質(zhì)的結(jié)合和移植以后的角膜透明度情況，通過(guò)特殊染色觀察神經(jīng)的再生情況（圖14－17，彩圖54），裂隙燈顯微鏡和組織切片則可檢查組織工程化角膜基質(zhì)的透明性、可降解性以及生物反應(yīng)性。

圖14－17　豬角膜基質(zhì)植入新西蘭白兔角膜層后1個(gè)月，神經(jīng)開始恢復(fù)

PLGA作為構(gòu)建角膜基質(zhì)的支架材料，實(shí)驗(yàn)中將培養(yǎng)的角膜基質(zhì)細(xì)胞接種到PLGA材料上，構(gòu)建成角膜基質(zhì)細(xì)胞－PLGA復(fù)合物，光學(xué)顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)，角膜基質(zhì)細(xì)胞能與PLGA牢固地結(jié)合，材料對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性。細(xì)胞－PLGA復(fù)合物移植到同純種兔角膜基質(zhì)層間后（圖14－18，彩圖55），開始不透明，移植1周后，復(fù)合物的透明度逐漸增加，但是由于降解小分子的作用，4個(gè)月左右出現(xiàn)角膜血管新生。裂隙燈及組織切片檢查證明，雖然在PLGA降解的過(guò)程伴隨新生血管增生，但PLGA周圍的角膜組織始終保持透明，無(wú)任何水腫和免疫排斥反應(yīng)性炎癥。新生血管的產(chǎn)生可能與PLGA降解產(chǎn)物乙醇酸和乳酸有關(guān)，由于角膜代謝率低，液體流動(dòng)差，降解產(chǎn)物乳酸會(huì)刺激新生血管形成。另外，組織切片可見(jiàn)，部分接種的細(xì)胞增殖后的排列方向按原角膜基質(zhì)纖維排列的方向塑形，但是結(jié)構(gòu)仍比較零亂，呈半透明狀。兔移植實(shí)驗(yàn)表明，PLGA不是一種合適的基質(zhì)構(gòu)建材料，由于它在降解的過(guò)程中會(huì)刺激新生血管形成，影響角膜的透明度，因此有待于進(jìn)一步的改性處理。

圖14－18　PLGA復(fù)合物移植到兔角膜基質(zhì)層間

近期，Griffith的研究小組進(jìn)一步改進(jìn)了以膠原為主要成分的角膜基質(zhì)的構(gòu)建方法。他們利用多種技術(shù)交聯(lián)高濃度的膠原，不但保持了角膜的透明度，而且所獲的基質(zhì)材料機(jī)械強(qiáng)度大大增強(qiáng)，接近于眼庫(kù)角膜。并且對(duì)膠原為主要成分的基質(zhì)復(fù)合物進(jìn)行改進(jìn)，應(yīng)用高分子親水性材料和細(xì)胞黏附多肽序列的混合物代替硫酸鹽，這些新構(gòu)建的生物角膜已被用于兔的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)，術(shù)后炎癥和免疫反應(yīng)輕微，并且獲得了生物角膜表面的上皮化和神經(jīng)的再生。

（二）板層角膜的移植實(shí)驗(yàn)

構(gòu)建的板層角膜可以進(jìn)行重建眼表的試驗(yàn)，首先制備動(dòng)物眼表?yè)p傷模型，然后應(yīng)用顯微板層角膜切削刀去除損傷的板層角膜，最后進(jìn)行重建的角膜移植實(shí)驗(yàn)。光學(xué)顯微鏡、電鏡觀察上皮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和神經(jīng)再生，裂隙燈顯微鏡和組織切片檢查組織工程化角膜基質(zhì)的透明性。利用羊膜為載體構(gòu)建的角膜上皮層已經(jīng)開始應(yīng)用于臨床（圖14－19，彩圖56；圖14－20，彩圖57），但是由于羊膜透明度不夠高，可能傳播多種疾病，而且移植后仍然需要進(jìn)一步的角膜移植，因此羊膜的廣泛應(yīng)用受到一定的限制。

圖14－19　羊膜為載體構(gòu)建的角膜上皮層

Han的研究小組近期成功構(gòu)建了由人

圖14－20　板層角膜重建眼表

類角膜上皮干細(xì)胞和交聯(lián)的纖維素凝膠基質(zhì)構(gòu)成的組織工程化眼表組織。他們對(duì)人類角膜上皮干細(xì)胞進(jìn)行了體外分離、培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)人類角膜上皮干細(xì)胞懸浮種植到Ⅷ因子交聯(lián)的纖維連接蛋白／纖維素凝膠中，培養(yǎng)后細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化，表達(dá)AE5抗原。

利用自體角膜緣干細(xì)胞構(gòu)建的板層角膜免疫原性低，是構(gòu)建板層角膜理想的選擇。另外，隨著對(duì)于成體干細(xì)胞的深入研究，角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)建系成為可能，這將為多種構(gòu)建方案提供充足的種子細(xì)胞，從而為角膜疾病的個(gè)體化治療帶來(lái)希望。

（三）全層角膜的移植

全層角膜的移植條件苛刻，需要合適的內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)增效率低，而且必須達(dá)到一定的密度才起正常作用，所以利用自體細(xì)胞體外擴(kuò)增構(gòu)建角膜難度較大。目前外多采用轉(zhuǎn)染永生化基因的內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)建角膜內(nèi)皮層。內(nèi)皮細(xì)胞將是構(gòu)建全層角膜最后的突破點(diǎn)。