一、成骨細(xì)胞的鑒定

1867年，Cohnheim首先提出了骨髓內(nèi)含有MSCs的觀點(diǎn)。Feiedenstein在20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可分化為成骨細(xì)胞，成軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞等，Owem稱這種細(xì)胞（能分化為定向祖細(xì)胞）為骨髓MSCs。

近10年來，對(duì)各種誘導(dǎo)物的作用進(jìn)行了較多的研究。Kamalia等通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇能調(diào)節(jié)正在分化細(xì)胞的基因表達(dá)，誘導(dǎo)基因組目的序列皮質(zhì)醇受體的親和性，增加APase活性，促進(jìn)集落形成，因此，皮質(zhì)醇有誘導(dǎo)骨髓MSCs分化為成骨細(xì)胞作用，促分化的同時(shí)也抑制了骨髓MSCs增生。Walsh等發(fā)現(xiàn)生理需要量的地塞米松（DEX）沒有促進(jìn)細(xì)胞數(shù)量的增加，但有促進(jìn)它向成骨方向分化和成熟的作用，而超生理量的DEX則對(duì)成骨細(xì)胞的更新和骨髓MSCs的成熟，保持其子代的特性有影響，但分化成成骨細(xì)胞的數(shù)量卻減少。Otsuka等證實(shí)維生素C能通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞特異性分化蛋白基因的表達(dá)來誘導(dǎo)堿性磷酸酶（ALP）活性的增加，促進(jìn)ST2細(xì)胞（一種鼠的骨髓MSCs）向成骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。同時(shí)證實(shí)維生素C能增加鈣鹽的沉積和促進(jìn)鈣化骨結(jié)節(jié)的形成。Mc　Qillan等揭示β－甘油磷酸鈉可以為骨細(xì)胞分化和增殖提供磷原子，能增加ALP在成骨細(xì)胞中表達(dá)從而促進(jìn)生理性鈣鹽的沉積、促進(jìn)鈣化。1，25（OH）2維生素D3可促進(jìn)骨祖細(xì)胞增殖，它還可以在無DEX、17β雌二醇、維生素C的情況下誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化并能增加ALP的活性，且對(duì)MSCs向成骨細(xì)胞分化的影響成劑量依賴性。

（一）兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與鑒定

1．取材　4～8周齡健康新西蘭大白兔，雌雄不限，自股骨大轉(zhuǎn)子部抽吸雙側(cè)股骨骨髓共3ml，混入含15%胎牛血清的1　640完全培養(yǎng)基（青霉素和鏈霉素各100U、維生素C　50μg／ml）10ml中反復(fù)抽吸吹打。

2．細(xì)胞培養(yǎng)　將上述細(xì)胞懸液經(jīng)4號(hào)針頭反復(fù)抽吸制成單細(xì)胞懸液，以3×106／ml細(xì)胞數(shù)接種入50ml培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱中，5d后半量換液（1　640完全培養(yǎng)基），以后2～3d全量換液1次。待細(xì)胞匯合成單層后消化，以1×105／ml接種于培養(yǎng)皿中，進(jìn)入傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)使用條件培養(yǎng)基（1　640完全培養(yǎng)基中加入地塞米松10－8　mol／L、β－甘油磷酸鈉10mmol／L）。細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)20～30d，常規(guī)3d換液1次。

3．鑒定?、俚怪蔑@微鏡逐日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)變化特點(diǎn)。②掃描電鏡觀察，分別將培養(yǎng)6、12、20d長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋玻片取出，經(jīng)戊二醛固定、丙酮脫水、乙酸異戊酯置換，臨界點(diǎn)干燥，表面噴金后掃描電鏡觀察。③透射電子顯微鏡觀察，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，戊二醛前固定，四氧化鋨后固定、丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，樹脂浸透，經(jīng)包埋、聚合后超薄切片，鈾、鉛染色，透射電鏡觀察。④堿性磷酸酶染色，將培養(yǎng)3周的附有細(xì)胞的蓋玻片取出，采用改良Gomori鈣鈷法測(cè)定，每張蓋玻片隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算ALP陽性細(xì)胞率。⑤鈣結(jié)節(jié)染色將傳代培養(yǎng)3～4周的附有細(xì)胞的蓋玻片取出，Von－Kossa染色。

（二）人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與鑒定

1．取材　在無菌條件下，以穿刺針垂直穿刺髂骨骨髓腔，刺入骨髓腔2～3cm，骨穿針后套20ml注射器，注射器事先吸入1ml抗凝液（組成：每1　000U肝素加入1ml DMEM無血清培養(yǎng)液），將抗凝液注入骨髓腔，反復(fù)抽取骨髓20ml。

2．細(xì)胞培養(yǎng)　立即注入2只50ml離心管中，事先加入10ml抗凝液，1　000r／min，離心10min，棄去上清液，以PBS清洗3次，取出上層脂肪及組織液，下層即為包含MSCs的細(xì)胞層。將骨髓基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至8個(gè)培養(yǎng)皿（20mm×100mm）中，加入骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液（含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液），置CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。5d后換液，以去除未貼壁血細(xì)胞，以后每3d換液1次。

3．鑒定?、俚怪蔑@微鏡：觀察原代及傳代細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育情況，主要觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。原代細(xì)胞18～20d可長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞接近長(zhǎng)滿后用0．25%胰酶消化傳代，以1×104／cm2密度接種于培養(yǎng)皿中，倒置顯微鏡下觀察。②生長(zhǎng)曲線測(cè)定：取生長(zhǎng)良好的第4代細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／ml，接種于100mm培養(yǎng)皿，每皿接種2ml，置于CO2孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，每日取出3個(gè)培養(yǎng)皿，0．25%胰酶消化，計(jì)算每皿細(xì)胞數(shù)，取均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。計(jì)算倍增時(shí)間。連續(xù)觀察17d。未計(jì)數(shù)細(xì)胞每3d換液1次。③堿性磷酸酶染色和HE染色：取第4代細(xì)胞，胰酶消化后，接種到小的蓋玻片上，細(xì)胞長(zhǎng)滿后取出，PBS漂洗，95%乙醇固定，行堿性磷酸酶染色和常規(guī)HE染色。④礦化結(jié)節(jié)染色：取第4代細(xì)胞，胰酶消化，接種在25ml培養(yǎng)瓶中，用礦化液（含20%胎牛血清、2nmol／Lβ－甘油磷酸鈉、50μg／ml維生素C、10nmol／L地塞米松）連續(xù)培養(yǎng)30d，在倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。取30d標(biāo)本，95%乙醇固定后行Von－Kossa染色，觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。

二、體內(nèi)成骨能力的鑒定

（一）放射學(xué)檢查

術(shù)后按設(shè)計(jì)拍手術(shù)肢體正側(cè)位X線片。麻醉后固定，條件（羊）：電壓55kV，電流55mA，曝光時(shí)間0．3s，焦距900mm。所有X線片用光密度儀做光密度測(cè)定，為消除每次拍片顯影劑條件等的不同，每張片測(cè)定骨缺損中央與相鄰軟組織的光密度，骨缺損光密度與軟組織光密度的比值做比較（圖9－10）。

（二）生物力學(xué)檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)適于修復(fù)動(dòng)物四肢長(zhǎng)管骨段缺性骨缺損。取剔除軟組織材料，測(cè)量外徑和長(zhǎng)度，濕潤(rùn)條件下在材料試驗(yàn)機(jī)上測(cè)定所取檢測(cè)材料垂直最大壓縮載荷及彈性模量，以100N／s加載（羊脛骨），做三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測(cè)試載荷（F）并計(jì)算彎曲應(yīng)力（δ），δ＝8FL／лd3，其中L為試件固定距離，均為100mm，d為骨缺損斷裂處的外徑（圖9－11，彩圖24）。

（三）組織學(xué)檢查

圖9－10　組織工程骨修復(fù)山羊脛骨骨缺損的放射學(xué)檢查

圖9－11　組織工程骨修復(fù)山羊脛骨骨缺損的生物力學(xué)檢測(cè)（壓應(yīng)變）

1．軟切片　體積分?jǐn)?shù)10%的中性甲醛溶液固定，常規(guī)酸性脫鈣液脫鈣，乙醇逐級(jí)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，HE染色光鏡觀察。

2．硬切片　4%多聚甲醛固定后常規(guī)梯度乙醇脫水，有機(jī)樹脂包埋。于硬組織切片機(jī)切成5μm超薄片12張，分別行Masson染色、甲苯胺藍(lán)染色，光鏡下觀察骨缺損愈合情況、材料變化、周圍炎性反應(yīng)。

（四）電鏡觀察

標(biāo)本經(jīng)3%戊二醛固定，PBS液沖洗，0．1%EDTA脫鈣，1%鋨酸固定水洗，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂浸透，包埋，半薄切片定位，超薄切片，電子染色，電鏡觀察。

三、組織工程骨再血管化的鑒定

（一）放射性核素骨顯像監(jiān)測(cè)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（山羊）麻醉后，將其俯臥于木架上，四肢固定，探頭距雙脛骨100mm，經(jīng)小腿淺靜脈注入Tc99m－MDP（185MBq／10kg）4h后檢查，以1幀／5min采集一幅靜態(tài)圖像，能峰140keV，窗寬20%，矩陣512×512，縮放1．0。影像處理：以術(shù)側(cè)缺損區(qū)10mm× 20mm大小的矩形為感興趣區(qū)，鏡像法取健側(cè)感興趣區(qū)。使用感興趣區(qū)（ROI）計(jì)數(shù)，計(jì)算T／NT比值（術(shù)側(cè)ROI單位像素的計(jì)數(shù)（每pixel）／健側(cè)ROI單位像素的計(jì)數(shù)（每pixel）進(jìn)行定量測(cè)定，以進(jìn)行對(duì)比分析（圖9－12，彩圖25）。

圖9－12　組織工程骨修復(fù)山羊脛骨骨缺損的放射性核素骨顯像監(jiān)測(cè)（紅色區(qū)域顯示血供豐富）

（二）墨汁灌注

動(dòng)物（以觀察大鼠顱骨為例）在被處死前均在全麻下顯露雙側(cè)頸總動(dòng)脈（或主動(dòng)脈、股動(dòng)脈，視動(dòng)物情況而定），向動(dòng)脈遠(yuǎn)心端插入兩根直徑為1mm的硅膠管，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈近心端，固定遠(yuǎn)心端插管并快速推注1　500U肝素及20mg戊巴比妥鈉以處死動(dòng)物。迅速斷頭并放出余血，自雙側(cè)插管內(nèi)緩慢低壓灌注預(yù)熱至39℃的墨汁／甲醛混合液（墨汁∶甲醛＝6∶1，直至大鼠頭面部皮膚黏膜及眼底均呈現(xiàn)黑色為止（約需5ml）。靜置2h后剝離頭骨并在體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液緩沖液中固定3d，制成80μm脫鈣切片及100μm不脫鈣磨片，或系列脫水透明后保存于冬青油中以觀察墨汁灌注情況（圖9－13，彩圖26）。

圖9－13　組織工程骨修復(fù)山羊脛骨骨缺損后墨汁灌注（可見墨汁灌注顯示血管）

（三）特殊染色

Van　Gieson染色能特異的顯示血管壁，可以用作觀察切片內(nèi)的血管化情況。骨組織固定于10%甲醛液，按常規(guī)脫水包埋，切片脫蠟。用Weigert鐵蘇木精液染5～10min，流水稍洗，1%鹽酸乙醇迅速分化，自來水沖洗。用Van　Gieson液（甲液：1%酸性品紅水溶液，乙液：苦味酸飽和水溶液，甲、乙兩液分瓶盛放。臨用前取甲液1份，乙液9份混合后使用）復(fù)染約30s。傾去染液，95%乙醇分化，無水乙醇脫水。二甲苯透明，中性樹膠封固。通過對(duì)不同層面切片的成骨面積及血管數(shù)量和血管橫截面積比的測(cè)定，可用于觀察成骨及血管生成情況。

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院　陳　濱）

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