一、轉(zhuǎn)化

重組DNA分子體外構(gòu)建完成后，必須導入特定的宿主（受體）細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。在基因克隆技術(shù)中，轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實驗技術(shù)之一。

自然條件下，轉(zhuǎn)化現(xiàn)象在原核生物中是較普遍的，很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi)。但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的 mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉(zhuǎn)移，如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，首先受體細菌需是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，其次受體細菌需處于感受態(tài)。

在分子生物學實驗技術(shù)體系中，感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化是基本的實驗操作。

感受態(tài)細胞（competent cells）是指受體細胞經(jīng)過一些特殊方法[如電擊法，CaCl2、RbCl（KCl）化學試劑法]處理后，細胞膜通透性發(fā)生了暫時性的改變，處于能允許外源 DNA 分子進入的狀態(tài)。

目前常用的感受態(tài)細胞制備方法有CaCl2和RbCl（KCl）法。RbCl（KCl）法制備的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl2法簡便易行，且其轉(zhuǎn)化效率一般能達到每微克5×106～2×107轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒DNA，完全可以滿足一般的基因克隆實驗，故CaCl2法更常用。

CaCl2 法最先由Cohen在1972年發(fā)現(xiàn)。其原理是細菌在低溫、低滲（0℃，0.1mol/L CaCl2）的溶液中，菌體膨脹成球形，外來的DNA可形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復(fù)合物黏附于細胞表面，經(jīng)42℃短暫熱沖擊處理，促使DNA復(fù)合物進入細胞，從而實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)化。

【材料】

1．細菌 如大腸桿菌DH5 α菌株：R－（限制酶缺陷型）、M－（甲基化修飾缺陷型）、Amp－。

2．試劑

（1）LB 固體和液體培養(yǎng)基（營養(yǎng)培養(yǎng)基）。

（2）氨芐青霉素（Amp）母液：配成 100mg/ml水溶液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）含Amp 的 LB 固體培養(yǎng)基（選擇培養(yǎng)基）：將LB 固體培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻至 60℃ 左右，加入Amp母液，調(diào)節(jié)終濃度為 50μg/ml，搖勻后鋪板。

（4）0.1mol/L CaCl2溶液：稱取 0.56g無水CaCl2 （分析純），溶于 50ml水中，定容至 100ml，高壓滅菌后備用。

（5）含15%甘油的 0.1mol/L CaCl2 ： 稱取 0.56g無水CaCl2 （分析純），溶于50ml水中，加入15ml 甘油，定容至100ml，高壓滅菌備用。

3．設(shè)備 超凈工作臺、恒溫搖床、離心機、分光光度計、 水浴鍋、微量移液器。

【操作步驟】

1．感受態(tài)細胞的制備及保存

涂板時可同時做2個對照實驗。

對照組 1：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，其他操作與上面相同。正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。此組結(jié)果用于判斷Amp的抗性是否有效，以及實驗操作中是否有雜菌污染。

對照組 2：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，但涂板時只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。此組結(jié)果用于判斷感受態(tài)細胞活性和狀態(tài)是否正常。

【注意事項】

1．細胞的生長狀態(tài)和密度 最好從－70℃或－20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。不要用已經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接，及儲存在4℃的培養(yǎng)菌液，即一定使用新鮮、幼嫩的細菌來制備感受態(tài)細胞。細胞生長密度控制在每毫升5×107個左右培養(yǎng)液為佳，即一定采用處于對數(shù)期或?qū)?shù)生長前期的細菌，密度過高或不足均會使轉(zhuǎn)化率下降。

2．試劑的質(zhì)量 所用的試劑，如CaC12等均需是最高純度的，如優(yōu)級純（guaranteed reagent，GR）或分析純（analytical reagent，AR），并用超純水配制，滅菌后保存于干燥的冷暗處。

3．質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時，則會使轉(zhuǎn)化率下降。一般情況下，DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細胞體積的5%，1ng的超螺旋態(tài)DNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。

對于以質(zhì)粒為載體的重組分子，其轉(zhuǎn)化效率與重組子的分子量大小有關(guān)。一般，重組子分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。實驗證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進行轉(zhuǎn)化。此外，轉(zhuǎn)化效率也與重組DNA分子的構(gòu)型密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10～100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。

4．防止雜菌和雜DNA的污染 整個操作過程均應(yīng)在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管、tip頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理，所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其他試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或者導致雜DNA的轉(zhuǎn)入，為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。

5．整個操作過程均需在冰上進行，以維持細菌的感受態(tài)狀態(tài)，否則將會降低細胞的轉(zhuǎn)化率。

【結(jié)果與分析】

1．實驗結(jié)果及分析 經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)后，在涂布質(zhì)粒DNA的平板上，可看到有大量的菌落生長，且分布比較均勻。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化比較成功，轉(zhuǎn)化子比較多。而且由于質(zhì)粒中含有抗性基因，受體菌生長良好，所以在平板上可以看到大量的菌落。

2．常見問題及解析 見表8-3。

表8-3 基因轉(zhuǎn)化常見問題及解析

二、轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染是指用病毒或以它為載體構(gòu)建的外源核酸重組子導入真核細胞的過程，核酸包括DNA（質(zhì)粒和線性雙鏈DNA），反義寡核苷酸及小分子干擾RNA（small interfering RNA，SiRNA）?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究（基因表達調(diào)控、基因功能、信號轉(zhuǎn)導和藥物篩選研究）和基因治療研究。

常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時轉(zhuǎn)染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝，產(chǎn)生高水平的表達，但通常只持續(xù)幾天，需要在外源基因?qū)爰毎?～4d后收獲細胞進行分析，多用于啟動子和其他調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24～96h內(nèi)分析結(jié)果，常用一些報告系統(tǒng)（如熒光蛋白、β-半乳糖苷酶等）來幫助檢測。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。但經(jīng)過一些選擇性標記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶、胸苷激酶（thymidine kinase，TK）等反復(fù)篩選，可以得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞株。外源DNA發(fā)揮作用時間較長，多用于基因治療等的研究；但其整合到染色體中的概率很低，約為1/104轉(zhuǎn)染細胞，而且線性DNA比超螺旋DNA，轉(zhuǎn)入量低但整合率高。

瞬時轉(zhuǎn)染常采用一些物理、化學的方法，如磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導法、電擊法（電穿孔技術(shù)）、DEAE葡聚糖法、細胞顯微注射法等。下面以Invitrogen公司的LipofectAMINETM2000試劑盒轉(zhuǎn)染CHO貼壁細胞為例，作一簡單介紹。

【材料】

1．細菌 CHO細胞。

2．試劑

（1）脂質(zhì)體LipofectAMINETM2000（Invitrogen）。

（2）無血清培養(yǎng)基OPTI-MEM（Gibco）。

（3）轉(zhuǎn)染級質(zhì)粒。

（4）轉(zhuǎn)染溶液Ⅰ（每孔）：240μl 無血清培養(yǎng)基 + 10μl LipofectAMINETM 2000 。

（5）轉(zhuǎn)染溶液Ⅱ（每孔）：Xμl 無血清培養(yǎng)基 + 4μg質(zhì)粒（總體積250μl）。

3．設(shè)備 6孔細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)箱。

【操作步驟】

【注意事項】

1. 細胞的狀態(tài) 做轉(zhuǎn)染時，一定要確保細胞處于最佳的生長狀態(tài)，這點非常重要。不要使用傳了很多代的細胞，例如傳代不要超過17代。使用傳3代左右的細胞，效果更好。因為傳代次數(shù)過多，細胞的形態(tài)可能會發(fā)生變化，嚴重影響實驗結(jié)果。

2. 細胞的融合度 應(yīng)選擇在細胞融合度為80%～90%時進行轉(zhuǎn)染，此時轉(zhuǎn)染的效率最高。因為在一定范圍內(nèi)細胞密度增加，其對脂質(zhì)體的耐受性也增加，轉(zhuǎn)染后細胞受到的影響較?。坏敿毎芏冗^高，會影響脂質(zhì)體復(fù)合物與細胞的充分接觸，使有效轉(zhuǎn)染的細胞數(shù)目減少，轉(zhuǎn)染效率反而降低。

3. 脂質(zhì)體的濃度 在一定范圍內(nèi)，脂質(zhì)體濃度與轉(zhuǎn)染效率呈正比，但超過一定的界限后，由于脂質(zhì)體對細胞的毒性作用，轉(zhuǎn)染效率隨著脂質(zhì)體濃度的增加呈非線性增加，轉(zhuǎn)染效率明顯降低。因此，應(yīng)通過實驗篩選適宜的脂質(zhì)體濃度或參考相應(yīng)試劑盒的操作指導。

4. 脂質(zhì)體與DNA的比率 脂質(zhì)體與DNA的質(zhì)量比主要決定了所形成的復(fù)合物的電荷性質(zhì)及穩(wěn)定性。當脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物組成比例合適時，復(fù)合物性質(zhì)穩(wěn)定，易于被細胞內(nèi)吞而提高轉(zhuǎn)染效率；當脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物比例不合適時，過多的DNA會影響復(fù)合物的穩(wěn)定性，而過多的脂質(zhì)體則會增加對細胞的毒性，從而降低轉(zhuǎn)染效率。

5. 轉(zhuǎn)染孵育時間 轉(zhuǎn)染孵育時間的長短決定了復(fù)合物能否與細胞充分吸附融合，完成外源基因的轉(zhuǎn)入。若轉(zhuǎn)染時間太短則導致轉(zhuǎn)染不充分，轉(zhuǎn)染時間太長則細胞無法耐受脂質(zhì)體的毒性作用，因此轉(zhuǎn)染時間太短或太長都將影響轉(zhuǎn)染效率。一般轉(zhuǎn)染48h后mRNA表達最高，72h后蛋白表達最高。

6. 無血清培養(yǎng)基 用無血清培養(yǎng)基代替PBS清洗細胞，可以提高轉(zhuǎn)染效率。洗時輕輕沿邊緣緩緩加入液體，不要吹吸細胞，通過轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板讓液體在細胞表面流動和清洗。

后續(xù)加入無血清培養(yǎng)基5～6h后更換全培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)時間過長，會對細胞造成毒性損傷。

7. 質(zhì)粒的質(zhì)量 要實現(xiàn)高效率轉(zhuǎn)染，使用的質(zhì)粒一定要純度好、濃度高、無內(nèi)毒素污染，濃度不低于0.35μg/μl。

三、病毒的包裝

病毒載體是常用的分子生物學工具之一，利用病毒具有傳送其基因組進入宿主細胞進行感染的分子機制可將遺傳物質(zhì)帶入細胞。這一過程可發(fā)生于完整活體（in vivo）或是細胞培養(yǎng)（in vitro）中，在基礎(chǔ)研究、基因治療和或疫苗研制中發(fā)揮著重要作用。

目前常用的病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體和單純皰疹病毒載體等?；蚬こ讨惺褂玫倪@些載體都經(jīng)過了分子改造，在病毒的基因組中去除了與病毒致癌、毒性和復(fù)制相關(guān)的基因等片段，在合適的位置插入外源基因，從而發(fā)展成為基因傳遞的工具。因此，這些基因工程的病毒載體都只有感染能力，而沒有病毒相關(guān)的復(fù)制能力，即是復(fù)制缺陷型病毒載體。因此，構(gòu)建好的病毒載體需要在一個特殊的細胞系統(tǒng)中進行增殖，這個細胞即是包裝細胞。

包裝細胞（packaging cell）是通過基因工程技術(shù)對細胞進行修飾，使其產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)基因所編碼的蛋白，為病毒載體包裝成為重組病毒提供全面的病毒蛋白。包裝細胞并不能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生編碼完整病毒的基因組RNA，因此，包裝細胞本身不能產(chǎn)生任何形式的病毒顆粒。也就是說，包裝細胞的目的只是整合質(zhì)粒，形成帶有目的基因的病毒，再用該病毒感染目的細胞。

反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系是通過將gag、pol、env基因?qū)爰毎麖亩蛊涑蔀榫哂羞@些基因的穩(wěn)定細胞系。但這些細胞系并不包含RNA病毒上的包裝序列ψ的編碼結(jié)構(gòu)蛋白，因此，用包裝細胞系產(chǎn)生的是不含gag、pol、env基因的病毒顆粒，從而保證了其在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。

反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細胞系比較多，如屬于NIH/3T3細胞類型的PA317和PT67包裝細胞系，來源于轉(zhuǎn)染腺病毒E1A基因的人腎上皮細胞系293細胞，以及轉(zhuǎn)化了SV40大T抗原的293細胞的衍生物293FT和293T細胞。

包裝時，為了降低危險性以及形成基因缺陷性的假病毒顆粒，通常設(shè)計成2個包裝載體或多個包裝載體。例如，目前較為常用的是基于HIV-1的第三代慢病毒載體系統(tǒng)，它包括：①編碼病毒核心蛋白（gag）和病毒復(fù)制所需酶類（pol）的質(zhì)粒；②編碼rev蛋白的質(zhì)粒；③編碼水泡性口炎病毒G蛋白（VSVG）的包膜蛋白的質(zhì)粒；④攜帶目的基因的慢病毒載體。通過瞬時轉(zhuǎn)染上述元件到293T細胞可以產(chǎn)生復(fù)制缺陷型的慢病毒。

病毒載體經(jīng)包裝細胞包裝后產(chǎn)生的是假病毒，即包裝出來的病毒并不是活病毒，這種病毒只能感染一次，感染至目的細胞后，目的細胞不能再產(chǎn)生病毒，因為目的細胞沒有病毒的胞膜蛋白基因，不能形成病毒顆粒。

需要注意的是包裝細胞系對于許多基因一直不能達到高的反轉(zhuǎn)錄病毒的滴度，且不同的包裝細胞系對不同基因的表達水平有較大的差異。