早在1948年J.萊德伯格就用伊紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基，內(nèi)含伊紅黃、甲基藍(lán)和乳糖）分離到許多不能發(fā)酵乳糖的突變菌Lacˉ。能夠發(fā)酵乳糖的野生型菌Lac＋在EMB培養(yǎng)基上生成的菌落呈暗紅色，Lacˉ突變菌的菌落呈灰白色，這是很好的實驗系統(tǒng)，它把一個生化性狀轉(zhuǎn)變?yōu)楹苋菀鬃R別的形態(tài)性狀。但是，分析表明不能發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，即表型為Lacˉ的細(xì)菌的遺傳基礎(chǔ)不一定是相同的。有些Lacˉ突變是由于β半乳糖苷酶的缺陷，稱為LacZˉ突變。LacZˉ突變菌不能像Lac＋菌那樣使產(chǎn)色性底物O-硝基苯酚-β-半乳糖苷水解后產(chǎn)生O-硝基苯酚。但有些Lacˉ菌能水解這種產(chǎn)色性底物，說明這些細(xì)菌不是Zˉ突變菌。進(jìn)一步分析表明Lacˉ可能起源于三種不同的基因突變：

LacZˉ，β半乳糖苷酶缺陷突變；

LacYˉ，半乳糖透性酶缺陷突變；

LaaAˉ半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷突變。

當(dāng)然，在實驗過程中也分離到了一些雙重或三重突變型細(xì)菌。

不久，J.萊德伯格又發(fā)現(xiàn)了一種新的突變型，它不是乳糖發(fā)酵缺陷菌，而是有關(guān)乳糖發(fā)酵的三種酶的合成不再依賴于誘導(dǎo)物的存在。顯而易見，這不是編碼這三種酶的結(jié)構(gòu)基因的突變，而是酶合成調(diào)控中十分重要的“誘導(dǎo)（induction）”特性的改變。從這種突變型細(xì)菌分離到的與乳糖發(fā)酵有關(guān)的三種酶的結(jié)構(gòu)和功能都是正常的。這種突變菌定名為LacIˉ，它并不是編碼酶的結(jié)構(gòu)基因（structuregene）發(fā)生了突變，而是調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因發(fā)生了突變，所以它是調(diào)節(jié)基因（regulatorgene）突變菌，這種突變使細(xì)菌失去了“誘導(dǎo)”表型，原來的誘導(dǎo)酶成了組成酶，是一種組成型突變。

對于LacIˉ的性質(zhì)也可以有兩種可能的假設(shè)：一是LacIˉ突變細(xì)胞內(nèi)有一種“固有的誘導(dǎo)物”；二是細(xì)胞內(nèi)缺乏一種“活性抑制物”。為了解決這又一個“二中擇一”的問題，帕迪（A.Pardee）、雅各布和莫諾一起做了一個判斷性實驗。

圖1-27　在E.coli Lacl＋Z＋SmsT6sHfr與LaclˉZˉ SmrT6rFˉ雜交實驗中，受體菌產(chǎn)生的部分合子的β半乳糖苷酶的合成和誘導(dǎo)物存在的關(guān)系（改自G.S.Stent）

接合前和接合期內(nèi)培養(yǎng)基中不含誘導(dǎo)物，在供體LacI＋Z＋基因進(jìn)入受體細(xì)胞后分別加入噬菌體T6和鏈霉素（Sm）以殺死供體細(xì)胞。不加誘導(dǎo)物的為對照組，實驗組在供體細(xì)胞被殺死后加入誘導(dǎo)物。

他們用LacI＋Z＋細(xì)菌和LacIˉZˉ細(xì)菌做雜交實驗（關(guān)于細(xì)菌雜交的本質(zhì)、性因子F的結(jié)構(gòu)和特性，以及高頻F轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)等都將在第2章中詳細(xì)討論。這里需要了解的是，F(xiàn)因子是一個能整合于細(xì)菌的環(huán)狀DNA分子，并使環(huán)狀DNA斷裂，進(jìn)而從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞）。整個實驗過程如圖1-27所示，先將生長于無誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上的LacI＋Z＋Hfr（供體菌）和生長于同樣培養(yǎng)基上的LacIˉZFˉ（受體菌）做接合雜交實驗，觀察雜交細(xì)胞是否有Z基因編碼的酶產(chǎn)生。雜交前，培養(yǎng)基上沒有誘導(dǎo)物，所以Lac I ＋Z＋H fr菌不能產(chǎn)生酶，而LacIˉZˉFˉ突變菌雖是組成型突變，但因Zˉ突變而失去產(chǎn)生β半乳糖苷酶的能力。在雜交結(jié)合發(fā)生后1 h，Hfr菌的Z＋基因進(jìn)入Fˉ細(xì)胞，酶的合成就開始了，很快I＋基因也進(jìn)入Fˉ細(xì)胞，酶的誘導(dǎo)被阻抑而停止β半乳糖苷酶的合成；如果在這時加入誘導(dǎo)物，酶的合成又會迅速恢復(fù)，表明酶的合成又變?yōu)檎T導(dǎo)型的了，即酶的合成又以誘導(dǎo)物的存在為前提了。

怎樣用這個實驗來回答剛才提出的“二中擇一”問題？如果說LacIˉ細(xì)胞中有“固有的誘導(dǎo)物”，那么當(dāng)Z＋基因進(jìn)入LacIˉ細(xì)胞后就應(yīng)使β半乳糖苷酶的合成轉(zhuǎn)為組成型。事實上，由于I＋基因的進(jìn)入而阻抑了Z＋基因的表達(dá)。因此，莫諾等認(rèn)為LacI＋基因的產(chǎn)物是一種“能抑制遺傳信息從結(jié)構(gòu)基因傳給蛋白質(zhì)”的阻遏物。起先他們認(rèn)為I＋基因產(chǎn)生的阻遏物是一種RNA分子，后來因發(fā)現(xiàn)了LacI基因的溫度敏感突變和琥珀型無義突變菌，才提出阻遏物是一種蛋白質(zhì)。直到1967年，美國哈佛大學(xué)的吉爾伯特（W.Gilbert）和米勒希爾（B.Müller-Hill）才用實驗證實I＋基因的產(chǎn)物是一種阻遏蛋白。

要搞清阻遏物的性質(zhì)，最好的辦法是分離純化并研究它的結(jié)構(gòu)。但是大腸桿菌細(xì)胞中的阻遏物數(shù)量非常少，一般情況下，每個細(xì)胞只有10個分子，約占細(xì)胞蛋白總量的0.001%，提取這樣微量的蛋白質(zhì)幾乎是不可能的。吉爾伯特和米勒希爾用兩種方法來增加細(xì)胞中阻遏物的含量：一是選出一種LacIsq突變菌，這是調(diào)控I基因表達(dá)的突變型，這種突變使I基因表達(dá)加強(qiáng)，LacIsq細(xì)胞中阻遏物含量也因而增加；二是用噬菌體將Lac區(qū)段轉(zhuǎn)導(dǎo)入LacIsq細(xì)胞，增加細(xì)胞內(nèi)I基因的拷貝數(shù)。綜合這兩項措施，細(xì)胞中阻遏物的含量可達(dá)20 000個分子，占細(xì)胞蛋白總量的2%，為提取和純化阻遏物創(chuàng)造了條件。

吉爾伯特和米勒希爾在上述細(xì)胞的提取液中，加入35S標(biāo)記的IPTG，使之與阻遏物結(jié)合。然后把與IPTG結(jié)合且具有放射性的蛋白質(zhì)分離純化，并做分子量測定和動力學(xué)研究。結(jié)果表明阻遏物是一個分子量為37000的四聚體，每個單體有一個誘導(dǎo)物的結(jié)合位點，它和IPTG的解離常數(shù)為10-6 mol/L。

關(guān)于誘導(dǎo)現(xiàn)象還有一點必須注意，誘導(dǎo)物誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的不一定是有活性的酶。當(dāng)細(xì)胞的β半乳糖苷酶基因發(fā)生突變后，很可能會合成一種沒有酶的活性、卻又能和β半乳糖苷r酶的抗體起反應(yīng)的肽鏈，稱為交叉反應(yīng)物質(zhì)（crossreaction material，CRM）。實驗研究表明，當(dāng)用誘導(dǎo)物IPTG處理大腸桿菌Lac Zˉ突變菌時，細(xì)胞會被誘導(dǎo)合成大量的CRM。所以在誘導(dǎo)過程中誘導(dǎo)物可以不是誘導(dǎo)酶作用的底物，誘導(dǎo)物誘導(dǎo)產(chǎn)生的也不一定是有活性的酶蛋白。這兩種反應(yīng)在化學(xué)上是“無故”或“無效”事件，但具有極為重要的生理學(xué)意義，它是生物機(jī)體在各種信號分子調(diào)節(jié)下成為自主、自律功能體的基礎(chǔ)。活細(xì)胞并不完全服從化學(xué)規(guī)律。

在闡明LacI基因的產(chǎn)物（阻遏蛋白）性質(zhì)的同時，人們還會提出一個新的問題：在沒有誘導(dǎo)物時，阻遏蛋白是怎樣同時抑制編碼與乳糖發(fā)酵和利用有關(guān)的三種酶的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的？或者說，阻遏蛋白的多效阻遏作用的靶標(biāo)是什么？