第二節(jié)　細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

一、概念

利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。

二、技術(shù)依據(jù)及原理

本法系用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)及內(nèi)毒素在二價(jià)陽(yáng)離子的參與下，作用于鱟血凝集酶系統(tǒng)而發(fā)生的一系列酶聯(lián)反應(yīng)，最后形成凝膠，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。內(nèi)毒素單位用EU表示。

細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品系自大腸桿菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品系以細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及設(shè)置的各種陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品中每1mg細(xì)菌內(nèi)毒素的效價(jià)應(yīng)不小于2EU，不大于50EU。

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水系指與靈敏度為0.03EU/ml或更高靈敏度的鱟試劑，在37℃±1℃條件下24h不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的滅菌注射用水。

三、試驗(yàn)準(zhǔn)備

試驗(yàn)所用器皿需經(jīng)處理，除去可能存在的外源性內(nèi)毒素，常用的方法是250℃干烤至少1h，也可用其他適宜的方法，并應(yīng)確證不干擾細(xì)菌內(nèi)毒素的檢查。試驗(yàn)操作過程應(yīng)防止微生物的污染。

四、鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)

鱟試劑靈敏度定義為在本檢查法規(guī)定的條件下能檢測(cè)出內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液或供試品溶液中的最低內(nèi)毒素濃度，用EU/ml表示。

根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（λ），將細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15min，然后制成2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ等4個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘，按檢查法項(xiàng)下試驗(yàn)，每一濃度平行做4支，同時(shí)用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水做2支陰性對(duì)照管，如最大濃度2.0λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管均為陰性，按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λ）。

λC＝lg^－1（∑X/4）

公式中的X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是系列濃度遞減的內(nèi)毒素溶液中最后一個(gè)呈陽(yáng)性結(jié)果的濃度。

當(dāng)λ在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時(shí)，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以λ為該批鱟試劑的靈敏度。每批新的鱟試劑在用于試驗(yàn)前都要進(jìn)行靈敏度的復(fù)核。

五、供試品干擾試驗(yàn)

按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和未檢出內(nèi)毒素的供試品溶液或其不超過最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的稀釋液，分別將同一支（瓶）細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成含細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ等4種濃度的內(nèi)毒素溶液。用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和用供試品溶液或其稀釋液制成的每一濃度平行做4支，另取細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和供試品溶液或其稀釋液各做2支陰性對(duì)照管。如最大濃度2.0λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對(duì)照管均為陰性時(shí)，按下式計(jì)算用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液或其稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。

Es＝lg^－1（∑X_S/4）

Et＝lg^－1（∑X_t/4）

式中E_S、E_t分別為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水和供試品溶液或其稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。

當(dāng)Es0.5λ～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）時(shí)，且當(dāng)Et在0.5Es和2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）時(shí)，則認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾試驗(yàn)，否則使用更靈敏的鱟試劑，對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋或采用其他適合排除干擾作用的方法。當(dāng)鱟試劑、供試品的來(lái)源、供試品的配方或生產(chǎn)工藝有變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。

供試品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按下式計(jì)算：

MVD＝CL/λ

式中L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；C為供試品溶液的濃度。其中當(dāng)L以EU/ml表示時(shí)，C為1.0ml/ml；當(dāng)L以EU/mg或EU/u表示時(shí)，C的單位為mg/ml或u/ml。

六、檢查法

取裝有0.1ml鱟試劑溶液的10ml×75mm試管或復(fù)溶后的每支0.1ml規(guī)格的鱟試劑原安瓿5支，其中2支加入0.1ml按最大有效稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液作為供試品管，1支加入0.1ml用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2.0λ濃度的內(nèi)毒素溶液作為陽(yáng)性對(duì)照管，1支加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照管，1支加入0.1ml供試品陽(yáng)性對(duì)照溶液〔用被測(cè)供試品溶液將同一支（瓶）細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品制成2.0λ濃度的內(nèi)毒素溶液〕作為供試品陽(yáng)性對(duì)照管。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃適宜恒溫器中，保溫60min±2min。保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動(dòng)造成假陰性結(jié)果。

七、結(jié)果判斷

將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180°時(shí)，管內(nèi)凝膠不變形，不從管壁滑脫者為陽(yáng)性，記錄為（＋）；凝膠不能保持完整并從管壁滑脫者為陰性，記錄為（－）。供試品2支均為（－），應(yīng)認(rèn)為符合規(guī)定；如2支均為（＋），應(yīng)認(rèn)為不符合規(guī)定；如2支中1支為（＋），1支為（－），按上述方法另取4支供試品管復(fù)試，4支中1支為（＋），即認(rèn)為不符合規(guī)定。陽(yáng)性對(duì)照管為（－）或供試品陽(yáng)性對(duì)照管為（－）或陰性為（＋），試驗(yàn)無(wú)效。