培養(yǎng)細胞的檢測_組織工程學實驗技

一、培養(yǎng)細胞DNA的提取

培養(yǎng)的真核細胞在蛋白酶K、SDS、RNA酶的作用下，消化破裂細胞膜與核膜，蛋白質(zhì)變性并降解成小肽或氨基酸；DNA從核蛋白中游離，與蛋白質(zhì)分開，同時RNA酶降解污染的RNA。用飽和酚、氯仿抽提使蛋白質(zhì)與DNA脫離，在高鹽存在下用乙醇沉淀收集DNA，最后得到欲提取的DNA。

【實驗用品】

1．器材　移液器、低溫離心機、冰箱、Tip頭、Eppendorf管、紫外分光光度計、水浴箱。

2．試劑

（1）DNA提取液：10mmol／L　pH8．0 Tris－HCl、0．1mol／L　pH8．0EDTA、20μg／ml胰RNA酶、0．5%SDS。

（2）TE緩沖液：10mmol／L　pH8．0Tris－HCl、1mmol／L　pH8．0EDTA。

（3）其他試劑：20mg／ml蛋白酶K、3mol／L　pH5．2醋酸鈉（NaAc）、Tris－HCl pH8．0飽和酚、10mmol／L　pH7．4PBS、氯仿∶異戊醇（24∶1）、無水乙醇。

3．材料　體外培養(yǎng)的細胞。

【操作步驟】

1．對于懸浮培養(yǎng)的細胞，以1　500g　4℃離心10min收集細胞，棄培養(yǎng)液。用預冷的PBS液離心洗滌細胞2次。按5×106／ml加入DNA提取液，懸浮細胞，37℃水浴溫育1h。

2．對于貼壁生長的細胞，棄培養(yǎng)液，用預冷的PBS液漂洗滌細胞3次，盡量除凈瓶內(nèi)PBS，按5×106／ml加入DNA提取液至瓶內(nèi)，晃動瓶至液體變黏稠。將其移入離心管內(nèi)，37℃水浴溫育1h。

3．加入蛋白酶K到終濃度為100～ 200μg／ml，上下轉(zhuǎn)運混勻。37℃水浴溫育3h或37℃水浴過夜，裂解細胞、消化蛋白。保溫過程中，應不時轉(zhuǎn)運離心管，混勻反應液。

4．加入等體積的飽和酚溶液溫和地上下轉(zhuǎn)動離心管5～10min，直至水相與酚相混勻成乳狀液。5　000g離心15min，用大口吸管小心吸取上層黏稠水相，移至另一離心管中。重復酚抽提1次。加等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），上下倒轉(zhuǎn)混勻，5　000g離心15min，用大口吸管小心吸取上層黏稠水相，移至另一離心管中。重復1次。

5．加入1／5體積的3mol／L　NaAc及2倍體積的預冷的無水乙醇，室溫下慢慢搖動離心管，待乳白色絮狀DNA出現(xiàn)后，用牙簽或玻璃棒小心挑取DNA，轉(zhuǎn)入另一離心管中，加70%乙醇1ml，5　000g離心5min洗滌DNA，棄上清，去除殘余的鹽。

6．室溫盡量揮發(fā)殘留的痕量乙醇，但不要讓DNA完全干燥。按5×107個細胞DNA提取物加TE液1ml溶解DNA。溶解過程通常需要12～24h。

7．DNA的濃度測定：取DNA溶液用TE液做適量稀釋，以TE液做空白對照，在紫外分光光度計讀取A260和A280的光密度值。按以下公式計算濃度：DNA濃度（μg／μl）＝A260×50×稀釋倍數(shù)／1　000。

8．DNA純度的判定：A260／A280比值應在1．7～2．0之間。

【注意事項】

1．器皿和試劑的無DNA酶化處理：通過高壓、干烤等方法去除試劑、器材等的DNA酶。

2．仔細吸取酚抽水相：酚抽提離心后，轉(zhuǎn)移上層水相時，用大口吸管非常緩慢地將上層含DNA相吸入吸管內(nèi)，勿帶動界面。

3．避免DNA大分子剪切：提取過程中每一步的混勻，動作不可劇烈，防止機械剪切對林分子DNA的破壞而不能獲得大分子的DNA。75%乙醇洗滌DNA后晾干時，注意不要讓DNA完全干燥，否則極難溶解。

二、DNA的凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是分離、鑒定和純化DNA片段的首選標準方法。瓊脂糖的濃度變化所形成大小不同的分子篩網(wǎng)孔，可分離不同分子量的核酸片段。

【實驗用品】

1．器材　電泳儀、移液器、水平式凝膠電泳槽、紫外線檢測儀、微波爐、照相機等。

2．試劑　5×TBE：54．0g　Tris、27．5g

硼酸、20ml　0．5mol／L　pH8．0EDTA，用時10倍稀釋；溴化乙錠（ethidium　bromide，EB）：用水配制成10mg／ml的儲存液，分裝，避光4℃保存；6×加樣緩沖液：0．25%溴酚藍、0．25%二甲苯青FF、40%（W／V）蔗糖溶液，4℃保存；電泳級瓊脂糖。

【操作步驟】

1．用膠帶紙將洗凈、干燥的電泳凝膠床的兩端開口封好，形成一個膠模，水平放在工作臺的位置上。

2．用TBE電泳緩沖液在水浴上或微波爐上將瓊脂糖顆粒用最短時間完全溶解，所用的濃度參見表3－3。熔化的瓊脂糖溶液冷卻到60℃時，加入溴化乙錠，使其終濃度為0．5μg／ml，充分混勻。

表3－3　凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍（kb）

3．在膠模上放置好梳子后，半溫熱凝膠倒入膠模中，凝膠的厚度在3～5mm之間。倒膠時要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。

4．凝膠凝固后，小心移去梳子和膠帶紙，將凝膠往往放入電泳槽。也可同時制作幾塊凝膠，待其固化后用保鮮紙包住以防水分揮發(fā)，4℃保存。

5．加入電泳緩沖液，使液面高出凝膠表面1～2mm，如加樣孔內(nèi)有水泡，用吸管小心吸出，以免影響加樣。

6．將樣品與上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內(nèi)。

7．蓋上電泳槽并通電，60～100V恒壓電泳，使DNA向陽極方向移動。

8．電泳完成后切斷電源，取出凝膠，直接在透射紫外燈下觀察。

9．用加紅色濾色鏡的相機，光圈放到最大，曝光15～30s，拍照留底，或在凝膠圖像分析儀上觀察分析并留底。

【注意事項】

1．電壓。要使大于2kb的DNA片段的分辨率達到最大，一般凝膠電泳的電場強度不超過5V／cm，對于大分子真核基因組DNA分子的電泳通常采用0．5～1．0V／cm電泳過夜，以取得較好的分辨率和整齊的帶型。

2．加樣。加樣時槍頭不要碰壞凝膠孔壁，否則DNA帶型不整齊。

3．為檢查電泳結(jié)果，樣品中應有對照樣品或分子量標準物。

4．EB是致癌物質(zhì)，應注意防護，紫外光對眼睛有害，觀察時應戴上護目鏡或防護面罩。

三、PCR技術(shù)

PCR是一種在體外由引物介導的特定DNA序列的酶擴增。PCR全過程是基于一套“三”步曲的若干輪次的循環(huán)組合而成。依次為DNA模板熱變性，雙鏈DNA解鏈成單鏈；在低溫下與引物退火，引物與單鏈DNA互補配對；在適宜溫度下Taq　DNA聚合酶催化引物延伸（擴增步驟），這三步稱為一個循環(huán)。PCR方法基于該循環(huán)的重復進行，這種酶促反應可將特異性DNA擴增率至少達到2×106拷貝。近年P(guān)CR技術(shù)得到廣泛應用，衍生出許多種PCR相關(guān)的新技術(shù)，本節(jié)主要介紹以DNA為模板的經(jīng)典PCR技術(shù)。

【實驗用品】

1．器材　DNA擴增儀、電泳儀、電泳槽、離心機、紫外檢測儀、移液器、Tip頭、Eppendorf管、照相機等。

2．試劑

（1）引物：用去離子水配成10～50μmol／L濃度，擴增時用量為1～2μl／100μl反應體積。

（2）Taq聚合酶：商品供應一般為5U／μl，擴增時用量為2～5U／100μl反應體積。

（3）PCR反應緩沖液：部分隨Taq酶提供給用戶，需要時自己配制，10×濃度如下：250～500mmol／L　KCl、100～500mmol／L pH8．4Tris－Cl、15～20mmol／L　MgCl2、0．5%Tween－20、1mg／L　BSA（組分ⅴ）。

（4）dNTPs：已有商品化中性混合液（2mmol，10×）供應，如需要自己配制，則將dATP、dGTP、dCTP、dTTP鈉鹽各10mg合并，加去離子水2ml溶解，用0．1mmol／L的NaOH調(diào)至pH7．0～7．5，分裝后－20℃保存（濃度為5mmol／L）。

（5）模板：用合適方法制備的模板DNA。

（6）其他試劑：無菌液體石蠟、瓊脂糖、溴化乙錠。

【操作步驟】

1．在一0．5ml　Ep管中加入下列各成分（按100μl反應體積計算）：二種引物各1～2μl、10×PCR反應緩沖液10μl、dNTPs（2mmol／L混合母液）10μl、模板1～5μl、去離子水補至100μl（包括Taq酶體積）。上述諸液混合后，離心15s，使液體沉至管底。加石蠟油30～50μl于反應表面，以防止加溫過程中液體蒸發(fā)影響反應體積。

2．95～97℃變性5～10min，水浴冷卻，加Taq酶（1U／μl）2～5μl，短暫離心。

3．開始循環(huán)依據(jù)設計的循環(huán)參數(shù)進行擴增：變性，90～94℃，30～50s；退火，25～65℃，60～90s；延伸，70～74℃，60～120s。反復循環(huán)25～35次，末次循環(huán)后，在延伸溫度再延時5min。

4．反應結(jié)果后，短暫離心，吸取少量擴增產(chǎn)物（5～10μl），加1～2μl上樣緩沖液，于適當濃度的瓊脂糖凝膠中進行電泳分析。為確定擴增產(chǎn)物是否符合設計要求，需選擇合適分子量DNA標準平行電泳。

【注意事項】

1．PCR中的對照設置　為確保結(jié)果的可肯定性，應設置陽性及陰性或空白對照，陽性對照為用已知陽性模進行擴增，陰性對照為加無關(guān)或不加模板DNA進行擴增。

2．模板制備　DNA提取過程中應注意避免DNA的降解并盡量使DNA中不含任何蛋白酶、核酸酶、Taq　DNA聚合酶抑制劑及能與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，以獲取理想的擴增結(jié)果。

3．引物設計與引物濃度　引物是欲擴增核酸片段兩端的已知序列，是保證PCR特異性擴增的關(guān)鍵因素。因此，應注意引物設計符合設計的一般原則。否則得不到特異性的擴增帶。引物濃度應通過預實驗確定最適引物濃度，范圍一般在0．2～1．0μmol／L。濃度太低可能得不到擴增結(jié)果或產(chǎn)量過低；太高易出現(xiàn)引物二聚體。

4．循環(huán)參數(shù)　PCR中控制溫度是關(guān)系到試驗成敗的重要環(huán)節(jié)。模板DNA的徹底變性是實驗進行的基礎，DNA解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。退火的溫度及時間依賴于引物的長度、濃度及堿基組成中GC的含量。退火溫度太低，易出現(xiàn)非特異擴增。一般來說，退火溫度為Tm值減去5℃。PCR中延伸的溫度要根據(jù)Taq　DNA酶的最適作用溫度而定，通常在70～75℃之間；延伸時間則依擴增片段和長度而定，正常情況下，每分鐘可延長1kb的長度，如果擴增的片段的150bp左右或更少，可省去此步驟。

四、Southern　Blot法

Southern雜交可用來檢測經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列。其主要步驟包括：基因組DNA的限制性酶切；將DNA片段電泳分離，經(jīng)變性后轉(zhuǎn)移并固定于支持膜上；預雜交以除去非特異性結(jié)合位點；以標記的探針進行雜交；通過放射自顯影或顯色反應檢查目的DNA性酶切片段的位置。

【實驗用品】

1．器材　電泳儀、電泳槽、紫外檢測儀、移液器、Tip頭、Eppendorf管、尼龍膜、吸水紙、新華3號濾紙、轉(zhuǎn)移槽、水浴箱、雜交爐、離心機、照相機、雜交袋、塑料封口機、X－膠片、X線暗盒、暗室與安全燈等。

2．試劑

（1）限制性內(nèi)切酶（以EcoRⅠ為例）10U／μl及適合該酶的緩沖液（10×buffer for　EcoRⅠ）。

（2）變性液：0．5mol／L　NaOH、1．5mol／L NaCl。

（3）中和液：0．5mol／L　pH7．4Tris－C、1．5mol／L　NaCl、1mol／L　NH4Ac、0．03mol／L　NaCl。

（4）轉(zhuǎn)移液：20×SSC（配制1　000ml：NaCl　175g，檸檬酸三鈉·2H2O　88g，H2O 800ml，1mol／L　HCl調(diào)至pH7．0，補水至1　000ml。分裝后高壓滅菌）；或20×SSPE（配制1　000ml：NaCl　174g，NaH2PO427．6g，EDTA－Na27．4g，H2O　800ml，用10mol／L NaOH調(diào)至pH7．4，補水至1　000ml。分裝后高壓滅菌）。

（5）預雜交液：6×SSC、5×Denhardt（常以50×Denhardt為儲備液，配制500ml：Ficoll40　5g，聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl　pyrrolidone，PVP）5g，牛血清清蛋白組分Ⅴ，加水溶解至500ml，過濾除菌并存放于－20℃、0．5%SDS、50%甲酰胺、100μg／ml變性斷裂鮭精DNA（應在1kb以下，1%瓊脂糖凝膠電泳，在溴酚藍之前；配制時稱取10mg，加無菌水1．0ml，加熱、超聲處理使之溶解，－20℃保存，使用前需煮沸5min變性后迅速放置冰?。?。

（6）其他試劑：0．5mol／L　pH8．0EDTA、雙蒸水、0．2mol／L　HCl、放射性標記的探針、顯影液與定影液、20%SDS。

（7）樣品：DNA樣品0．4～0．6μg／μl。

【操作步驟】

1．基因組DNA的限制性酶切　常用30μl反應體積設置反應體系：在一個1．5ml Ep管內(nèi)加入0．5μg／μl基因組DNA20．0μl、雙蒸水5．0μl、10×buffer　3．0μl、EcoRⅠ（10U／μl）2．0μl。離心數(shù)秒，使管壁液珠離心到管底，以保證反應體系體積準確。放置37℃水浴保溫3～6h；加入1／5體積的0．5mol／L EDTA終止反應（終濃度為12．5mmol／L）。

2．DNA的瓊脂糖凝膠電泳　見本節(jié)二。

3．DNA的轉(zhuǎn)移與固定　將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持膜（尼龍膜）的方法有毛細管轉(zhuǎn)移法、電轉(zhuǎn)移法及真空轉(zhuǎn)移法，這里介紹最常用最經(jīng)典的毛細管轉(zhuǎn)移法。

（1）電泳結(jié)束后照相，然后切去凝膠的邊角，并在膠的一角作好標記。

（2）將膠置于0．2mol／L　HCl中處理10min，如果檢測的DNA片段＜1kb，可不經(jīng)此步；如果＞1kb，可適當延長時間（10～20min）。當膠中溴酚藍由藍轉(zhuǎn)成橘黃色時，說明膠已處理透。

（3）棄去HCl溶液，用去離子水漂洗2次。隨后浸泡于數(shù)倍體積的變性液中15～45min后，換用中和液處理15～30min。

（4）按圖3－8示安裝轉(zhuǎn)移槽，注入足量轉(zhuǎn)移液。

圖3－8　典型的毛細胞管作用Southern轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（5）根據(jù)膠的大小裁剪尼龍膜及濾紙片（3～5張），同樣剪去膜的一角作標志。

（6）將膜平鋪在去離子水表面，直到濾膜從下到上濕透為止，然后將其轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移液中，至少5min，操作時戴手套，用平頭鑷。

（7）戴手套將在轉(zhuǎn)移液中泡好的濾紙片1～2張鋪到轉(zhuǎn)移臺上，驅(qū)逐氣泡。倒上少許轉(zhuǎn)移液，用大小適合的X線片將膠從中和液中托起，將加樣孔先接觸轉(zhuǎn)移臺，自一端起將滑放到濾紙上，注意不要留下氣泡。將浸泡好的尼龍膜放在膠上，使膜的上端對齊加樣孔。同樣檢查及排除氣泡。放上2～3層預先浸好轉(zhuǎn)移液的濾紙片，放上吸水紙10～15 cm高，上面加一塊平板，然后壓上0．5kg左右的重物（圖3－8）。注意重物使濾紙片、吸水紙之間有較好的接觸，發(fā)揮毛細胞虹吸作用。

（8）轉(zhuǎn)移持續(xù)8～24h，每當紙巾浸濕后更換新的紙巾。小片段轉(zhuǎn)移快，大片段轉(zhuǎn)移需要更長時間。

（9）轉(zhuǎn)移完畢，移去吸水紙，用平頭鑷將膜取出，在6×SSC溶液中浸泡濾膜5min，用濾紙吸干后夾在兩層干凈濾紙片中，置于80℃烤0．5～2h?？梢宰贤鉄粲^察凝膠，檢查轉(zhuǎn)移效果。

4．預雜交和雜交

（1）配制所需的適量預雜交液，按每平方厘米雜交膜約需0．2ml計算。

（2）將已轉(zhuǎn)移固定的雜交膜以6×SSC濕潤并浸泡2min。

（3）將濕潤的雜交膜裝入雜交袋中，按0．2ml／cm2加入預雜交液，浸透雜交膜之后，盡可能趕去氣泡，以塑料封口機密封袋口，使雜交間隙達到最小，然后置于雜交爐中42℃水浴預雜交2～6h。

（4）將已標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5～10min使之變性，然后迅速置冰浴中驟冷。

（5）從雜交爐水浴中取出已經(jīng)過預雜交的雜交袋，剪去雜交袋一角，通過制品向雜交袋中加入經(jīng)變性的標記探針。趕盡氣泡之后，用塑料封口機重新封口。于雜交袋外再套塑料袋，同樣以塑料封口機封口，置雜交爐42℃水浴中雜交6～12h。

（6）小心取出雜交好的濾膜，依下列次序進行洗膜：2×SSC，0．5%SDS，室溫5～10min；2×SSC，0．1%SDS，室溫，10～15min；0．1×SSC，0．5%SDS，42℃，30min；0．1×SSC，0．1%SDS，56～68℃，30min。

（7）用0．1×SSC于室溫短暫漂洗濾膜，將其置于一疊紙巾上，吸去大部分液體，空氣中干燥濾膜，以Saran膜包好濾膜，準備進行放射自顯影。

5．放射自顯影　在暗室中紅色安全燈下，按增感屏－X線片－增感屏的順序放置X線片，蓋緊暗盒，置－70℃自顯影24h以上，取出后沖洗X線片：室溫下將X線片顯影3～5min，以背景不過度為宜，清水沖洗之后，置于定影液中5～15min。顯影不足者，另放一張X線片，繼續(xù)自顯影5～7d或更長時間。

【注意事項】

1．為使Southern印跡雜交反應獲得滿意結(jié)果，經(jīng)酶解的DNA量要求在10μg左右。

2．為了及時了解酶反應的完成程度，可在反應到預定時間后，先取1～2μl進行微型凝膠電泳檢查，如果酶解不全，可補加少量酶，繼續(xù)反應2～3h。

3．放射性核素標記有損害性，手上也可能帶多種臟物污染X線片，故操作時要戴手套。

4．暗盒放在低溫冰箱中應避免震動，以防產(chǎn)生重影。

5．增感屏受污染后會降低效率或使本底升高，應精心保護，及時用乙醇棉球擦凈。

五、斑點雜交法

斑點雜交與Southern雜交較為相似，但斑點雜交能簡便、快速地檢測微量核酸，且可以半定量分析，事先也不用限制性內(nèi)切酶消化及用凝膠電泳分離核酸樣品，在一張固相支持膜上可同時進行多個樣品的檢測。

斑點雜交的原理是將DNA或RNA變性后直接點樣吸附于固相支持膜上，然后用標記探針與之雜交，洗滌去除未反應探針，采用放射自顯影或顯色反應檢測顯示雜交信號，分析結(jié)果。這里主要介紹用放射性核素標記的探針檢測DNA的斑點雜交方法。

【實驗用品】

1．器材　移液器、自動光密度掃描儀、Tip頭、Eppendorf管、尼龍膜、真空抽濾加樣器、水浴箱、雜交爐、雜交袋、塑料封口機、X－膠片、帶增感屏的X線暗盒、暗室與安全燈等。

2．試劑　20×SSC、50×Denhardt、10 mg／ml變性斷裂鮭精DNA（配制方法見本節(jié)三Southern　blot所述）；其他試劑：10% SDS、甲醛、去離子甲酰胺、1mol／L　pH7．0 Na2HPO4、0．5mol／L　pH8．0EDTA、雙蒸水、放射性標記的探針、顯影液與定影液、DNA樣品。

【操作步驟】

1．樣膜的制備

（1）樣品的預變性：取待測DNA樣品的量視情況而定，一般可加樣10～20μg，溶于水，煮沸5～10min，冰浴中迅速冷卻，使其變性。

（2）尼龍膜的預處理：戴上一次性手套，取尼龍膜按需要剪成合適大小，并剪掉一角作為點樣順序標記。如采用手工點樣，用鉛筆在尼龍膜上按0．8～1cm2的面積標上小格。用蒸餾水浸濕，再浸入6×SSC溶液中至少30min，將膜取出風干待用。

（3）點樣：可根據(jù)情況選用手工直接點樣或用真空抽濾加樣器（斑點或狹縫）點樣。手工直接點樣時用微量移液器將經(jīng)變性處理的DNA樣品依次點到尼龍膜的標記點上。斑點直徑不能過大，應控制在0．5cm2以內(nèi)。單個樣品分少量多次點樣，邊點樣邊風干。真空抽濾架器點樣時按其操作說明進行點樣。

（4）固定：點樣后的樣膜，置于濾紙上，室溫自然風干，然后80℃烤2h固定DNA樣品。固定的樣膜，封存于塑料袋內(nèi)待用（－20℃可保存若干月）。

2．預雜交和雜交

（1）配制所需的適量預雜交液，按每平方厘米雜交膜約需0．2ml計算。預雜交液各組分的濃度為：6×SSC、5×Denhardt、0．5% SDS、50%甲酰胺、100μg／ml變性斷裂鮭精DNA。

（2）將封存樣膜的塑料袋剪一角開口，加少量2×SSC使其濕潤，棄余液。按0．2ml／cm2加入預雜交液，盡可能趕去氣泡，以塑料封口機密封袋口，然后置于雜交爐中42℃水浴預雜交2～4h。

（3）將已標記的雙鏈DNA探針于100℃加熱5～10min使之變性，然后迅速置冰浴中驟冷。

（4）從雜交爐水浴中取出已經(jīng)過預雜交的雜交袋，剪去雜交袋一角，通過制品向雜交袋中加入經(jīng)變性的標記探針。趕盡氣泡之后，用塑料封口機重新封口。于雜交袋外再套塑料袋，同樣以塑料封口機封口，置雜交爐42℃水浴中雜交16～20h。

3．洗膜　小心取出雜交好的濾膜，根據(jù)目的序列的豐度、標記探針的要求，可采用高嚴謹性或低嚴謹性洗膜。

高嚴謹性洗膜為：2×SSC，0．1%SDS，室溫2次，每次15min；0．1×SSC，0．1% SDS，室溫2次，每次15min；0．1×SSC，0．1%SDS，55℃洗2次，每次15min。

低嚴謹性洗膜為：6×SSC，0．1%SDS，室溫2次，每次15min；2×SSC，0．1%SDS，室溫2次，每次15min；1×SSC，0．1%SDS，55℃洗2次，每次15min。

4．放射自顯影　見Southern雜交。

【結(jié)果觀察】　根據(jù)曝光點（或狹縫）的有無、強弱，可判定目的蛋白的有無及量的多少。利用“自動灰度掃描儀”掃描條帶，計算積分光密度值，可以進行半定量分析。