第三節(jié)　高效液相色譜法

一、概念

系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動(dòng)相泵入裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測(cè)定的色譜方法。注入的供試品，由流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進(jìn)入檢測(cè)器，由記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號(hào)。

二、技術(shù)依據(jù)及原理

液相色譜法是一種現(xiàn)代液體色譜法，其基本方法是將具有一定極性的單一溶劑或不同比例的混合溶液，作為流動(dòng)相，用泵將流動(dòng)相注入裝有填充劑的色譜柱，注入的供試品被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)進(jìn)行分離后，各成分先后進(jìn)入檢測(cè)器，用記錄儀或數(shù)據(jù)處理裝置記錄色譜圖或進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到測(cè)定結(jié)果。由于應(yīng)用了各種特性的微粒填料和加壓的液體流動(dòng)相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點(diǎn)。

高效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進(jìn)行分離的藥品的分析測(cè)定，特別是多組分藥品的測(cè)定、雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測(cè)定。有的藥品需在色譜分離前或分離后經(jīng)過衍生化反應(yīng)方能進(jìn)行分離或檢測(cè)。

三、儀器的使用要求

按國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局的計(jì)量檢定規(guī)程作定期檢定，應(yīng)符合規(guī)定。

儀器各部件應(yīng)能正常工作，管路為無(wú)死體積聯(lián)結(jié)，流路中無(wú)堵塞或漏液，在設(shè)定的檢測(cè)器靈敏度條件下，色譜基線噪音或漂移應(yīng)能滿足分析要求。

具體儀器在使用前應(yīng)詳細(xì)參閱操作說(shuō)明書。

四、操作前的準(zhǔn)備

1.流動(dòng)相的制備

用高純度的試劑配制流動(dòng)相，溶劑照紫外分光光度法進(jìn)行檢查，應(yīng)符合要求；水為新鮮的去離子水；凡規(guī)定的酸度用pH計(jì)進(jìn)行調(diào)節(jié)；配制好的流動(dòng)相通過適宜的0.45μm濾膜濾過；用前脫氣；配制足量的流動(dòng)相待用。

2.供試溶液的配制

供試品用規(guī)定溶劑配制成供試溶液。定量測(cè)定時(shí)，對(duì)照品溶液和樣品供試溶液均應(yīng)分別配制2份。溶液在進(jìn)入色譜儀前，經(jīng)0.45μm濾膜濾過。必要時(shí)，在配制供試溶液前，樣品需經(jīng)提取凈化，以免對(duì)色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或?qū)ιV干擾。

3.檢查上次使用記錄和儀器狀態(tài)

檢查色譜柱是否適用于本次試驗(yàn)，色譜柱進(jìn)出口位置是否與流動(dòng)相的流向一致，原保存溶劑與現(xiàn)用流動(dòng)相能否互溶，流動(dòng)相的pH值與該色譜柱是否相適應(yīng)，檢測(cè)器是否適用于本次試驗(yàn)，儀器是否完好，儀器的各開關(guān)位置是否處于關(guān)斷的位置。

五、操作

按高效液相色譜儀操作規(guī)程測(cè)定，含量測(cè)定的對(duì)照品和樣品供試溶液每份至少進(jìn)樣2次，由全部進(jìn)樣結(jié)果（n≥4）求得平均值，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）一般應(yīng)不大于1.5％。

色譜系統(tǒng)適用性試驗(yàn)應(yīng)符合要求，如按指定峰計(jì)算的理論板數(shù)（n）和拖尾因子（T）以及相鄰峰之間的分離度（R）。計(jì)算公式為：

式中：t_R2為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間；

　　　t_R1為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間；

　　　W₁及W₂為此相鄰兩峰的峰寬；

　　　W_0.05h為0.05峰高處的峰寬；

　　　d₁為峰極大至前沿之間的距離。

定量測(cè)定時(shí)，可根據(jù)供試品的具體情況采用峰面積法或峰高法。測(cè)定雜質(zhì)含量時(shí)，需采用峰面積法。

外標(biāo)法：用含對(duì)照品的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算：

式中：C_X為供試品的濃度（mg/ml）；

　　　A_X為供試品的峰面積或峰高；

　　　C_R為對(duì)照品的濃度（mg/ml）；

　　　A_R為對(duì)照品的峰面積或峰高。

內(nèi)標(biāo)法：用含對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的對(duì)照溶液所得色譜峰響應(yīng)值，按下式計(jì)算。

式中：A_s為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；

　　　C_s為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度（mg/ml）；

　　　C_R為對(duì)照品的濃度（mg/ml）；

　　　A_R為對(duì)照品的峰面積或峰高。

式中：A_X為供試品峰面積或峰高；

　　　C_X為供試品的濃度（mg/ml）；

　　　A'_S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰面積或峰高；

　　　C'_S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度（mg/ml）；f為校正因子。

面積歸一化法：由于峰面積歸一化法測(cè)定誤差大，因此，本法通常只能用于粗略考查供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。方法是測(cè)量各雜質(zhì)峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計(jì)算各峰面積占總峰面積的百分率，即得。

清洗和關(guān)機(jī)：樣品分析完畢，按高效液相色譜儀操作規(guī)程沖洗色譜系統(tǒng)，關(guān)機(jī)。

填寫儀器使用記錄，內(nèi)容包括日期、檢品、色譜柱、流動(dòng)相、柱壓、使用小時(shí)數(shù)、儀器完好狀態(tài)等。