第六節(jié)　反向系列探針雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)根據(jù)檢測目的和方法的不同，可分為液相雜交、固相雜交及細(xì)胞內(nèi)定位（原位）雜交。固相雜交又可分為斑點雜交、印跡轉(zhuǎn)移雜交。這類雜交技術(shù)的特點是將酶切產(chǎn)物或PCR擴(kuò)增片斷直接點膜或經(jīng)電泳后Southern轉(zhuǎn)移固定至膜上，與液相中標(biāo)記的特異探針雜交，這種雜交模式稱為正向分子雜交。應(yīng)用該法檢測待檢樣品時，一次反應(yīng)僅能與一種探針雜交，多用于檢測樣品中有無需擴(kuò)增的靶基因。如要對多個耐藥基因的多個突變位點同時進(jìn)行鑒定，則需與多種探針一一雜交反應(yīng)，繁瑣而費時，難以滿足臨床檢測要求。將一系列包括分枝桿菌屬、群、種特異的寡核苷酸探針固定于膜或微孔板上，與液相中待檢標(biāo)記的PCR產(chǎn)物雜交的模式被稱為反向分子雜交。 1989年，Saiki等首次結(jié)合PCR擴(kuò)增并應(yīng)用反向斑點雜交（reverse dot blot，RDB）方法，即PCR-反向斑點雜交（ PCR-RDB）技術(shù)同時檢測全血中β地中海貧血多種基因突變位點，使β地中海貧血基因突變診斷取得了飛躍式進(jìn)展。由于PCR-反向斑點雜交技術(shù)操作相對簡便、快速，且價格相對低廉，因而已經(jīng)在臨床檢測中應(yīng)用于基因分型、基因突變檢測和病原微生物菌種鑒定等領(lǐng)域。根據(jù)探針點樣形態(tài)和陣列的不同，該技術(shù)也可區(qū)分為反向系列探針雜交或線條探針雜交（line probe assay，LiPA）技術(shù)。

反向系列探針雜交技術(shù)原理是：預(yù)先將特定的寡核苷酸探針排列固定于固相載體上，采集待檢標(biāo)本，提取基因組DNA或RNA，應(yīng)用生物素修飾的特異引物擴(kuò)增DNA或反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增RNA，使PCR產(chǎn)物帶有生物素標(biāo)記，將PCR產(chǎn)物變性后與固定在膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶免疫顯色法檢測和判讀雜交結(jié)果。Rossau應(yīng)用Innogenetics公司開發(fā)的檢測結(jié)核分枝桿菌耐RFP基因型的試劑盒，通過反向雜交試驗檢測107例已知rpoB序列的結(jié)核分枝桿菌分離株4種突變類型和264株通過傳統(tǒng)藥敏試驗檢測的臨床分離株，檢測靈敏度為98%，特異性為100%。

Watterson等則對包括線條探針技術(shù)在內(nèi)的三種分子耐藥技術(shù)應(yīng)用于臨床分離株、痰標(biāo)本和支氣管灌洗液（BALF）的rpoB基因突變位點的檢測，結(jié)果表明，對于臨床分離株線條探針技術(shù)、錯配堿基擴(kuò)增技術(shù)和噬菌體擴(kuò)增技術(shù)的突變檢出率分別為100%（16/16）、93.8%（15/16）和100%（16/16）；對于臨床痰標(biāo)本和BALF，線條探針技術(shù)、錯配堿基擴(kuò)增技術(shù)突變檢出率分別為94.7%（36/38）和100%（38/38）。噬菌體擴(kuò)增技術(shù)不能直接對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。目前，國外已應(yīng)用該技術(shù)開發(fā)了檢測與RFP耐藥相關(guān)突變的商品化試劑盒，商標(biāo)名為INNO-LiPA Rif。該試劑盒以rpoB基因為檢測靶序列，設(shè)計了5個（S1～S5）探針與結(jié)核分枝桿菌野生型rpoB基因廣泛雜交，4個用于鑒定下列4種常見突變的R探針：R2,Asp516Val； R4a,His526Tyr； R4b,His526Asp； R5, Ser531Leu及1個結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒別探針。該試劑盒能將檢測和鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群與檢測該菌株RFP藥物敏感性同時進(jìn)行。目前的研究表明，與傳統(tǒng)藥物敏感性檢測方法和rpoB測序技術(shù)相比較，該試劑盒檢測與RFP耐藥有關(guān)的突變，敏感性為92%～98%，特異性為100%。目前已報道應(yīng)用的商品化的試劑盒，多限于檢測rpoB基因。但能同時檢測RFP和INH耐藥的試劑盒最近也已有報道。

研究結(jié)果顯示，反向系列探針雜交技術(shù)在臨床結(jié)核桿菌快速耐藥檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。與目前常規(guī)的實驗室鑒定方法和其他分子鑒定方法相比，具有明顯優(yōu)勢。首先，它可以在一次實驗中同時對多種耐藥基因的多種基因位點進(jìn)行快速基因型別鑒定，具有檢測信息量大的特點。其次，它可以直接對臨床痰標(biāo)本進(jìn)行檢測，而目前的噬菌體擴(kuò)增技術(shù)尚不能直接對臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。因此，實驗室常規(guī)的結(jié)核桿菌藥敏檢測時間可以從目前的4～6周縮短至6個小時，真正能起到指導(dǎo)臨床醫(yī)生及早準(zhǔn)確用藥的作用。另外，同DNA序列測定和最近幾年發(fā)展的DNA芯片技術(shù)相比，反向系列探針雜交技術(shù)不需昂貴的儀器設(shè)備，所以，更具有在臨床實驗室應(yīng)用的潛力。然而，國外已推出的結(jié)核桿菌耐藥基因檢測系統(tǒng)由于價格仍然較昂貴，目前僅限于發(fā)達(dá)國家臨床實驗室及研究之用。因此，研制開發(fā)適合在發(fā)展中國家臨床實驗室開展使用的新型反向系列探針雜交技術(shù)尤為必要。