1977年Alwine等人提出一種用于分析細(xì)胞總RNA或含poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子的大小和豐度的分子雜交技術(shù)，即Northern印跡技術(shù)（Northern blotting），也稱為RNA雜交。由于該雜交與用于分析DNA的Southern雜交技術(shù)的原理和方法類似，故被稱為Northern雜交，與之類似的還有被命名為Western blot的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)。Northern雜交自出現(xiàn)以來(lái)已得到廣泛應(yīng)用，成為分析mRNA的常用方法之一。

Northern雜交曾經(jīng)是應(yīng)用得最廣的技術(shù)之 ，盡管其分辨率和操作簡(jiǎn)易性都不如RT-PCR等方法，但依然是檢測(cè)、定量mRNA大小及在組織中表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)方法；靈敏度，而且這種膜可以重復(fù)利用。

對(duì)于以地高辛標(biāo)記探針的檢測(cè)，在雜交結(jié)束后加入結(jié)合有辣根過(guò)氧化物酶或堿性磷酸酶的抗地高辛單克隆抗體，它可以與地高辛標(biāo)記的探針特異性結(jié)合。隨后的檢測(cè)過(guò)程與上面介紹的生物素探針標(biāo)記的檢測(cè)相同。這些非放射性標(biāo)記物探針的雜交結(jié)果的檢測(cè)都已有商品化的檢測(cè)試劑盒。

（二）結(jié)果與分析

雜交結(jié)果常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 見(jiàn)表9-5。是能直接提供有關(guān)RNA完整性、不同的剪接信息及mRNA大小等信息的唯一方法，也是在同一張膜上直接比較同一信息在不同樣品中的表達(dá)豐度的首選方法，且具有高度特異性。操作上，膜雜交前可制備部分同源探針、可檢測(cè)所提取RNA的含量及質(zhì)量，而雜交過(guò)后的雜交膜若適當(dāng)保存，可存放數(shù)年后重復(fù)進(jìn)行雜交。

盡管具有很多優(yōu)點(diǎn)，Northern雜交也存在一些限制：首先，其操作步驟相當(dāng)繁瑣，且對(duì)RNase污染非常敏感，任何一步操作不當(dāng)都會(huì)嚴(yán)重影響分辨率，使得表達(dá)水平定量分析大打折扣，因此用不含RNA酶的試劑及耗材是非常必要的。Northern雜交所用水和離心管通常都用DEPC處理，使RNA酶滅活。其次，標(biāo)準(zhǔn)的Northern雜交分析靈敏度相對(duì)于RT-PCR來(lái)說(shuō)比較低。再次，Northern雜交分析在進(jìn)行多重探針?lè)治鰰r(shí)比較困難。為了檢測(cè)多種mRNA，通常需要先去除第一種探針再進(jìn)行第二種探針的雜交，這一操作很耗時(shí)，并且容易出現(xiàn)問(wèn)題。

一、Northern印跡雜交的基本原理

與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳。首先將分子量大小不同的RNA分離開(kāi)來(lái)，隨后將其原位轉(zhuǎn)移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標(biāo)記的DNA或RNA探針，依據(jù)其同源性進(jìn)行雜交，最后進(jìn)行放射自顯影（或其他非放射自顯影方法）檢測(cè)。以目標(biāo)RNA所在位置標(biāo)示其分子量的大小，而其顯影強(qiáng)度則可提示目標(biāo)RNA在所測(cè)樣品中的相對(duì)含量（即目標(biāo)RNA的豐度）。與Southern雜交不同的是，總RNA不需要進(jìn)行酶切，可直接應(yīng)用于電泳。另外，點(diǎn)樣前用羥甲基汞、乙二醛或甲醛使RNA變性，而不用能使RNA降解的NaOH。

圖9-8 Northern雜交實(shí)驗(yàn)的基本流程

Northern雜交的實(shí)驗(yàn)流程如圖9-8所示。待測(cè)靶RNA經(jīng)過(guò)變性處理后通過(guò)電泳進(jìn)行分離，之后再應(yīng)用轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將凝膠分離的RNA轉(zhuǎn)移至固相的支持物（如尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上。然后將已經(jīng)標(biāo)記的單鏈探針或變性雙鏈與固定于轉(zhuǎn)移膜上的目標(biāo)RNA進(jìn)行雜交。雜交后通過(guò)洗膜去除未結(jié)合的或非特異性結(jié)合的探針，檢測(cè)特異性結(jié)合的探針的標(biāo)記信號(hào)并分析結(jié)果。

二、Northern印跡雜交方法

Northern雜交方法是單一基因表達(dá)分析的首選方法，主要包括以下幾個(gè)步驟：①RNA的提取與質(zhì)量檢測(cè)； ②RNA的變性和分離； ③RNA轉(zhuǎn)移至固相支持物中；④固相RNA與探針?lè)肿与s交；⑤對(duì)特異性結(jié)合的探針?lè)肿舆M(jìn)行檢測(cè)和分析。其中每個(gè)步驟都有很多可以選擇的實(shí)驗(yàn)方法，必須根據(jù)所要檢測(cè)的RNA分子的大小、性質(zhì)、豐度等不同因素進(jìn)行選擇，此外還需考慮實(shí)驗(yàn)條件和儀器等，選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案來(lái)進(jìn)行。

所需材料、試劑、儀器概述如下。

材料：總RNA樣品或mRNA樣品、探針、模板DNA（25 ng）、尼龍膜或硝酸纖維素膜、 X線底片、底片暗盒等。

試劑：NorthernMax Kit、瓊脂糖、隨機(jī)引物、111TBq/mmol[α-32P]dCTP、DEPC、dNTP 混合物、Exo-free Klenow Fragment和10 ×緩沖液、Sephadex G-50、SDS、過(guò)氧化氫（雙氧水）、滅菌水等。

儀器：恒溫水浴箱、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、真空轉(zhuǎn)移儀、真空泵、UV 交聯(lián)儀、雜交爐、恒溫?fù)u床、脫色搖床、渦旋振蕩器、分光光度計(jì)、微量移液器、電爐（或微波爐）、離心管、燒杯、量筒、三角瓶等。

以下按照實(shí)驗(yàn)過(guò)程的順序介紹Northern雜交實(shí)驗(yàn)操作。

（一）總RNA的提取

Trizol法提取總RNA可參見(jiàn)第6章第三節(jié)，這里介紹兩種改良的方法。

方法1．改良異硫氰酸胍提取法

【材料】 主要試劑及其配制如下。

（1）異硫氰酸胍變性液

儲(chǔ)存液：在含484ml 水（經(jīng)DEPC處理），17.6ml 0.75mol/L檸檬酸鈉（pH 7.0）和26.4ml10%Sarkosyl的溶液中加入250g異硫氰酸胍，加熱至60～65℃并持續(xù)攪拌使之充分溶解。儲(chǔ)存液室溫保存?zhèn)溆茫ú怀^(guò)3個(gè)月）。

工作液：在每50ml儲(chǔ)存液中加入0.35ml 2-ME即配制成工作液。工作液于室溫下保存不超過(guò)1個(gè)月。工作液各成分的終濃度為：4mol/L異硫氰酸胍，25mol/L檸檬酸鈉（pH 7.0）， 0.5%（w/v）N-十二烷基肌氨酸（Sarkosyl），0.1mol/L巰基乙醇（2-ME）。

（2）2mol/L乙酸鈉（NaAc）緩沖液（pH 4.0）。

（3）水飽和酚（pH 3.5）。

（4）49∶1 （v/v） 氯仿/異戊醇。

（5）100%異丙醇。

（6）70%乙醇（用DEPC處理水配制）。

（7）DEPC處理后高壓滅菌水。

【操作步驟】

【注意事項(xiàng)】 RNA提取過(guò)程中，為了保證所提取的RNA的純度和完整性，有兩個(gè)方面的問(wèn)題需要特別注意：一是去除與RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)；二是避免內(nèi)外源RNase對(duì)RNA的降解。

在RNA的提取中，常采用的蛋白質(zhì)變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉（SDS）等。酚能有效變性蛋白質(zhì)，但也能溶解10%～15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA，且不能完全抑制RNase的活性。氯仿能克服酚的缺點(diǎn)，加速有機(jī)相與液相分層，最后用氯仿抽提可去除核酸溶液中的過(guò)量酚。少許異戊醇的作用是可以降低表面張力，從而減少核酸提取過(guò)程中的氣泡產(chǎn)生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。

為防止外源RNase的污染，所有實(shí)驗(yàn)用品均需用DEPC處理并高壓滅菌，所有試劑配制均需使用經(jīng)DEPC處理過(guò)的水并滅菌處理。內(nèi)源RNase的抑制采用異硫氰酸胍等強(qiáng)還原劑。為避免人體污染，所有實(shí)驗(yàn)操作均應(yīng)戴手套，避免人體直接接觸所有用品。

方法2．改良Krapp提取法

【材料】 主要試劑及其配制如下。

（1）RNA抽提液。

（2）異硫氰酸胍變性液。

儲(chǔ)存液：4mol /L異硫氰酸胍，20mmol/L EDTA，20mmol/L MES（pH 7.0）。

工作液：取400ml母液加入1.7ml 2-ME儲(chǔ)存在4℃條件下備用。

（3）RNA重懸液：2mol/L LiCl，10mmol/L NaAc，調(diào)整終體積為250ml，pH 5.2，滅菌后儲(chǔ)存在4℃條件下備用。

【操作步驟】

（二）RNA質(zhì)量檢測(cè)

提取的RNA需要對(duì)其質(zhì)量和數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)室常用的方法有紫外吸收值檢測(cè)和電泳檢測(cè)兩種（具體可參見(jiàn)第4章、第6章相關(guān)內(nèi)容）。

（三）RNA電泳

RNA電泳與DNA電泳不同之處在于其電泳過(guò)程是在變性條件下進(jìn)行的，以消除RNA中的二級(jí)結(jié)構(gòu)，保證RNA完全按分子大小分離。根據(jù)所用變性劑不同共分為3種：甲醛變性電泳、乙二醛變性電泳和羥甲基汞變性電泳。電泳后再將瓊脂糖凝膠中RNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，然后與探針雜交。下面以常用的甲醛變性電泳為例簡(jiǎn)介（根據(jù)需要選用適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)準(zhǔn)）。

【材料】 主要試劑及其配制如下。

（1）MOPS緩沖液（10×）：200mmol/L MOPS（pH 7.0），50mmol/L NaAc、10mmol/L EDTA。

準(zhǔn)確稱取41.86g MOPS、6.8g NaAc、3.72g EDTA，先用適量的DEPC處理水溶解NaAc，再將MOPS溶解其中，再加入已用同樣方法處理水溶解的EDTA，混勻后用2mol/L NaOH調(diào)整pH 至7.0，最后定容至1 000ml，過(guò)濾滅菌后避光保存。

（2）加樣緩沖液：50%甘油、1mmol/L EDTA、0.4%溴酚藍(lán)、0.4%二甲苯藍(lán)。

（3）甲醛（37%溶液，13.3mol/L）。

（4）去離子甲酰胺：將10ml甲酰胺和1g離子交換樹(shù)脂混合，室溫?cái)嚢? h后用Whatman濾紙過(guò)濾。等分成1ml于－70℃儲(chǔ)存。

（5）溴化乙錠：EB，10mg/ml。

（6）70%乙醇。

【操作步驟】

RNA樣品質(zhì)量分析：完整的總RNA樣品應(yīng)呈現(xiàn)出3條條帶，分別為28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA。其中28S rRNA條帶的亮度應(yīng)約為18S rRNA條帶亮度的2倍，這表明RNA樣品比較完整，基本無(wú)降解。如果2條帶的亮度反過(guò)來(lái)，則說(shuō)明RNA樣品已發(fā)生降解。如果在點(diǎn)樣槽內(nèi)或槽附近有熒光區(qū)帶，則表明RNA樣品中有DNA污染。植物總RNA中28S rRNA及18S rRNA在變性膠上的遷移率相當(dāng)于分子量5.1kb及2.0kb RNA的遷移率，以此可作為分子量的參考。

（四）將變性RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜

電泳完畢后，立即將RNA自瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜。有以下幾種轉(zhuǎn)移方法：毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法和電印跡法。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法如下所述，真空轉(zhuǎn)移法和印跡法則按有關(guān)儀器生產(chǎn)廠家產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以下以尼龍膜為例介紹將變性RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜的方法，硝酸纖維素濾膜的轉(zhuǎn)移方法與其類似。目前商業(yè)化的尼龍膜有兩種：未經(jīng)修飾的（中性的）和帶正電荷的尼龍膜。二者都能結(jié)合單鏈和雙鏈核酸，但在不同緩沖液中結(jié)合核酸的量不同，相應(yīng)RNA轉(zhuǎn)移所用的緩沖液亦不同。

【材料】

（1）轉(zhuǎn)移緩沖液1：0.01mol/L NaOH，3mol/L NaCl（用于堿性轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜）。

（2）轉(zhuǎn)移緩沖液2：20×SSC（3.0mol/L NaCl，0.3mol/L 檸檬酸三鈉，調(diào)至pH 7.0 ）（用于中性轉(zhuǎn)移至不帶電荷的尼龍膜）。

（3）其他試劑：0.05mol/L NaOH、6×SSC、去離子水。

（4）其他材料：尼龍膜、RNA電泳凝膠、玻璃皿、新的解剖刀或切紙刀、手套、平頭鑷子、一疊玻璃板、濾紙、紙巾。

【操作步驟】

（五）雜交與預(yù)雜交

由于使用的探針類型和標(biāo)記方法不同，Northern雜交的具體操作步驟各異，但主要包括預(yù)雜交、探針的變性、雜交、洗膜及結(jié)果顯示這幾個(gè)步驟。

預(yù)雜交和雜交過(guò)程使用的是同一種緩沖液，預(yù)雜交一定時(shí)間后，更換新鮮緩沖液，加入探針進(jìn)行雜交。目前經(jīng)常使用兩類緩沖液：標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液和高濃度SDS雜交緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)雜交液是一類常用的緩沖液，用SSC或SSPE與Denhardt試劑、SDS一起配制，臨用前加入變性鮭精DNA。高濃度SDS雜交液也稱為Church緩沖液，其配方最早是由Church和Gilbert提出的。Church緩沖液中加入高濃度的SDS，可以有效地消減背景，減少由于背景過(guò)高而雜交信號(hào)太低無(wú)法分辨的情況。此外，使用Church緩沖液無(wú)需加入變性鮭精DNA之類的DNA、RNA運(yùn)載體，以及硫酸葡聚糖、聚蔗糖和PVP等試劑，組成簡(jiǎn)單，配制方便。

選擇最適雜交反應(yīng)溫度對(duì)雜交技術(shù)來(lái)說(shuō)也非常重要。若反應(yīng)溫度低于解鏈溫度10～15℃，堿基順序高度同源的互補(bǔ)鏈可形成穩(wěn)定的雙鏈，錯(cuò)配對(duì)減少。若反應(yīng)溫度再低（Tm－30℃），雖然互補(bǔ)鏈之間也可形成穩(wěn)定的雙鏈，但互補(bǔ)堿基配對(duì)減少，錯(cuò)配對(duì)增多、氫鍵結(jié)合得更弱。因此，在實(shí)驗(yàn)前必須首先確定雜交溫度。通常有3種溫度可供試驗(yàn)，即最適復(fù)性溫度、嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)性溫度及非嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)性溫度。

最適復(fù)性溫度=Tm－25℃

嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)性溫度= Tm－10℃或15℃

非嚴(yán)謹(jǐn)復(fù)性溫度=Tm－30℃或35℃

有研究人員報(bào)道，反應(yīng)液中每增加1%的甲酰胺濃度，Tm值可降低0.72℃。因此，可用調(diào)節(jié)甲酰胺濃度的辦法來(lái)調(diào)節(jié)Tm。對(duì)于探針與靶序列沒(méi)有同源性，即低嚴(yán)謹(jǐn)度雜交時(shí)，通常在雜交液中加入30%～50%甲酰胺，并在較低溫度（37～42℃）下進(jìn)行雜交。

【材料】

（1）預(yù)雜交/雜交緩沖液

標(biāo)準(zhǔn)預(yù)雜交/雜交緩沖液：6×SSC（或6×SSPE）、5×Denhardt'試劑、0.5% （w/v）SDS，100 μg/ml鮭魚(yú)精DNA（臨用前加）。

20×SSPE（調(diào)至pH 7.4）：3.0mol/L NaCl，0.2mol/L NaH2PO4，0.02mol/L EDTA。

50×Denhardt試劑：1%（w/v）聚蔗糖，1%（w/v）PVP，1%（w/v）BSA。

Church 緩沖液：0.5mol/LPBS（pH 7.2）、1mmol/L EDTA、1%（w/v）BSA、7% （w/ v）SDS。

（2）洗滌液：SSC（0.5×，l×和2×）含0.1 %（m/V）SDS，SSC（0.1×和0.5×）含0.1 %（m/V）SDS。

（3）3mol/L NaOH、lmol/L Tris-HCl（pH 7.2）、3mol/L HCl。

（4）探針。

【操作步驟】

2．化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

【材料】

（1）洗膜緩沖液：100mmol /L Maleic acid、150mmol/L NaCl、0.3%（v/v） Tween20（pH 7.5）。

（2） Maleic acid緩沖液：100mmol/L Maleic acid、150mmol/L NaCl（pH 7.5）。

（3） 封閉液：5% （w/v） SDS、17mmol/L Na2HPO4、8mmol/L NaH2PO4、室溫保存，如果需要，用0.45μm的濾膜過(guò)濾除菌。

（4） 檢測(cè)緩沖液：100mmol /L Tris-HCl（pH 9.5）、100mmol /L NaCl。

（5） TE緩沖液：10mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、1mmol /LEDTA。

（6） Anti-DIG-AP。

（7） CSPD: 25mmol CSPD（用前稀釋）。

【操作步驟】

3．NBT-BCIP熒光檢測(cè)

【材料】 Anti-Dig-AP、NBT、BCIP，其他同化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

【操作步驟】

（七） 雜交結(jié)果的分析

一般來(lái)說(shuō)，一個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本很少只在一種組織中表達(dá)，較常見(jiàn)的是在不同的組織中有不同的表達(dá)水平。即使在所有組織和不同細(xì)胞中都有表達(dá)的基因，它在不同組織中的表達(dá)仍存在一些差異。因此，建議在對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出任何結(jié)論之前，應(yīng)進(jìn)行多次X線膠片曝光分析。例如組織型纖溶酶原激活物，如果X線膠片曝光時(shí)間過(guò)短很可能會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)論，以為它只在肺和腎中表達(dá)。在基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平非常低的情況下（即使是在獲得cDNA探針的組織中），有必要將X線膠片曝光較長(zhǎng)時(shí)間。如果長(zhǎng)時(shí)間曝光也不能產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào)，則可以通過(guò)提高探針的比活性來(lái)增強(qiáng)其敏感性，也可以通過(guò)使用RNA探針來(lái)提高敏感性。

圖9-9源自某實(shí)驗(yàn)研究，圖中上部分顯示了各組織中agouti基因的表達(dá)情況，下部分表示常用內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）在相應(yīng)組織中的表達(dá)。agouti基因通常只在野生型小鼠皮膚中表達(dá)，該檢測(cè)結(jié)果表明這些組織中表達(dá)呈陽(yáng)性的agouti是轉(zhuǎn)基因小鼠特異性的。

圖9-9 Northern雜交結(jié)果實(shí)例

1-5道：BAPa20轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉、肝臟、小腸、腦、脂肪組織樣品；
6-10道：alb-agouti 86轉(zhuǎn)基因小鼠的肌肉、肝臟、小腸、腦、脂肪組織樣品

（八） Northern雜交常見(jiàn)問(wèn)題及解析

Northern雜交常見(jiàn)問(wèn)題及解析 見(jiàn)表9-6。

表9-6 Northern雜交常見(jiàn)問(wèn)題及解析

（續(xù)表）