二、定糖法（DNA、RNA含量的測(cè)定）

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1．了解定糖法測(cè)定核酸含量的原理。

2．掌握定糖法測(cè)定核酸含量的方法。

（二）實(shí)驗(yàn)原理

RNA分子在強(qiáng)酸作用下降解生成的核糖可在濃鹽酸作用下脫水生成糠醛，糠醛可與3，5-二羥基甲苯（地衣酚、苔黑酚）作用生成綠色復(fù)合物，其最大吸收峰波長為670nm，F(xiàn)e³⁺或Cu²⁺可作為催化劑催化反應(yīng)。反應(yīng)式如下：

DNA分子在強(qiáng)酸作用下降解生成的脫氧核糖可在乙酸和濃硫酸作用下脫水生成ω-羥基-γ-酮戊醛，該化合物可與二苯胺反應(yīng)生成藍(lán)色化合物，其最大吸收峰波長為595nm。反應(yīng)式見實(shí)驗(yàn)八。

（三）實(shí)驗(yàn)藥品、實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1．1 mol/L氫氧化鈉溶液；

2．100μg/mL RNA標(biāo)準(zhǔn)液：用稱量瓶準(zhǔn)確稱取含RNA10mg的酵母核糖核酸（按其含量進(jìn)行折算），加適量蒸餾水溶解，滴加數(shù)滴lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7，使其完全溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用蒸餾水洗滌稱量瓶2次，洗滌液合并入容量瓶，用蒸餾水定容，混勻；

3．RNA樣品溶液：用稱量瓶準(zhǔn)確稱取粗制RNA10mg，按上法配制或者取“核酸的提取、分離及鑒定”實(shí)驗(yàn)中提取的RNA溶液備用；

4．濃鹽酸（A.R.）；

5．地衣酚試劑：預(yù)先將地衣酚在苯中重結(jié)晶1～2次，用活性炭脫色，干燥后備用。稱取地衣酚0.1g，加濃鹽酸100mL使溶解，再加入二水合氯化銅（CuCl₂·2H₂O）0.15g，使其溶解，混勻；

6．100μg/mL DNA標(biāo)準(zhǔn)液：用稱量瓶準(zhǔn)確稱取含DNA 10mg的脫氧核糖核酸（按其含量進(jìn)行折算），加適量蒸餾水溶解，滴加數(shù)滴lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7，使其完全溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用蒸餾水洗滌稱量瓶2次，洗滌液合并入容量瓶，加蒸餾水至刻度，混勻；

7．DNA樣品溶液：用稱量瓶準(zhǔn)確稱取粗制DNA10mg，按上法配制，或者取“核酸的提取、分離及鑒定”實(shí)驗(yàn)中提取的DNA溶液備用；

8．冰乙酸（A.R.）；

9．濃硫酸（A.R.）；

10．二苯胺試劑：預(yù)先將二苯胺在70％乙醇中重結(jié)晶l～2次，干燥后備用，稱取重結(jié)晶二苯胺1g，加冰乙酸100mL使其溶解，再加入濃硫酸lmL，混勻，貯于棕色瓶中，該試劑應(yīng)為無色，如變色則氧化失效；

11．分光光度計(jì)；

12．分析天平；

13．電熱恒溫水浴箱；

14．水浴鍋；

15．容量瓶；

16．刻度吸管；

17．稱量瓶；

18．試管架；

19．15mm×150mm試管；

20．滴管。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1．RNA含量的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取試管6支，編號(hào)，按表4-2所示順序和劑量加入試劑。將各管混勻，置沸水浴中加熱20min，取出，水浴冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在670nm波長下，以“0”號(hào)管試液作參比溶液調(diào)零，測(cè)定各管吸光度。以RNA含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表4-2　定糖法測(cè)定RNA含量的工作曲線

（2）樣品RNA含量測(cè)定

取試管3支，分別標(biāo)以“空白管”和“測(cè)定管”（2支）。在空白管中加入蒸餾水1.0mL，在測(cè)定管中加入RNA樣品溶液1.0mL，然后每管加入地衣酚試劑3.0mL，混勻，置沸水浴中加熱20min，取出，水浴冷卻至室溫，用分光光度計(jì)，在670nm波長下，以空白管作參比液調(diào)零，測(cè)定樣品測(cè)定管吸光度，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出RNA含量，取平均值。

2．DNA含量的測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取試管6支，編號(hào)，按表4-3所示順序和劑量加入試劑。將各管混勻，置于60℃水浴中加熱60min，取出，水浴冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在595nm波長下，以“0”號(hào)管調(diào)零，測(cè)定各管吸光度。以DNA含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表4-3　DNA含量測(cè)定的工作曲線

（2）樣品中DNA含量測(cè)定

取試管3支，分別標(biāo)以“空白管”和“測(cè)定管”（2支）。在空白管中加入蒸餾水1.0mL，在測(cè)定管中加入DNA樣品溶液1.0mL，然后每管加入二苯胺試劑3.0mL，混勻，置于60℃水浴中加熱60min，取出，水浴冷卻至室溫，用分光光度計(jì)，在595nm波長下，以空白管調(diào)零，測(cè)定2支樣品測(cè)定管的吸光度，分別在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出DNA含量，取平均值。

3．結(jié)果計(jì)算

4．注意事項(xiàng)

（1）蛋白質(zhì)對(duì)RNA和DNA的測(cè)定均有干擾，因此在樣品蛋白質(zhì)含量高時(shí)，應(yīng)預(yù)先用5％三氯醋酸將蛋白質(zhì)除去，制備成無蛋白質(zhì)濾液后再測(cè)定。

（2）DNA對(duì)RNA的測(cè)定有干擾，在用Cu²⁺作催化劑時(shí)，同時(shí)有減少DNA干擾的作用，改良地衣酚法即用CuCl₂作催化劑。

（3）其他糖及其衍生物和醛類化合物對(duì)測(cè)定有干擾，應(yīng)盡量避免。

（五）實(shí)驗(yàn)記錄

1．RNA的含量測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。（2）實(shí)驗(yàn)記錄：

2．DNA的含量測(cè)定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

（2）實(shí)驗(yàn)記錄

（六）思考題

1．比較定糖法測(cè)定RNA和DNA含量，在實(shí)驗(yàn)原理上有哪些異同？

2．用定糖法測(cè)定RNA和DNA含量應(yīng)注意哪些問題？

3．用CuCl₂催化劑比用FeCl₃催化劑有哪些優(yōu)點(diǎn)？