任務(wù)6　食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗步驟

微生物檢驗的一般程序包括：樣品的采集→樣品的處理→樣品的檢驗→分析結(jié)果及報告。

1．采樣

在微生物檢驗過程中，樣品的采集是很重要的一個步驟。所采集的樣品必須具有代表性和均勻性，能反映全部被檢樣品的衛(wèi)生狀況，否則檢驗結(jié)果毫無價值。樣品種類可分為大樣、中樣和小樣三種。大樣指一整批；中樣是從樣品各部分取得的混合樣品，一般為200g；小樣是指分析檢驗用的試樣，一般為25g。采集的樣品一般應(yīng)一式三份，分別供檢驗、復(fù)驗及備查使用。根據(jù)樣品種類不同，采樣方法、采樣工具、容器及采樣數(shù)量亦有所不同。

1）固體樣品

（1）肉及肉制品。

生肉及臟器：剛屠宰的畜肉，可于開腔后用無菌刀取兩腿內(nèi)側(cè)肌肉各150g（或劈半后取兩側(cè)背最長肌肉各150g）；若是冷藏或銷售的生肉，可用無菌刀取腿肉或其他部位的肌肉250g。采集樣品后放入無菌容器內(nèi)，立即送檢；如條件不許可時，最好不超過3h。送檢時應(yīng)注意冷藏，不得加入任何防腐劑。樣品送往化驗室應(yīng)立即檢驗或放置于冰箱暫存。

禽類（包括家禽和野禽）：鮮、凍家禽取整只，放在無菌容器內(nèi)；帶毛野禽可放于清潔容器內(nèi)，立即送檢。

各類熟肉制品：包括醬鹵肉、肴肉、熟灌腸、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般取樣250g。熟禽取整只，放在無菌容器內(nèi)，立即送檢。

臘腸、香肚等生灌腸：取整根、整只，小型的可采取數(shù)根或數(shù)只，其總量不少于250g。

（2）蛋制品。

鮮蛋：用流動水沖洗外殼，再用75%酒精棉球擦拭消毒后放入滅菌袋中，加封，做好標(biāo)記后送檢。

罐裝全蛋粉、蛋黃粉、蛋白片：用75%酒精棉球?qū)Πb上的開口處進(jìn)行消毒，再將蓋開啟，用滅菌的雙套回轉(zhuǎn)取樣管斜角插入箱底，旋轉(zhuǎn)套管收集樣品，然后將樣品裝入滅菌廣口瓶中，每個檢樣不少于100g。

冰全蛋、冰蛋黃、冰蛋白：先用75%酒精棉球消毒容器開口處，將蓋開啟，然后用滅菌電鉆由頂?shù)降仔苯遣迦?，慢慢鉆取樣品，然后抽出電鉆，從中取出200g檢樣裝入滅菌廣口瓶中。

（3）乳制品。

常見的固態(tài)乳制品有奶粉、干酪及乳清粉等。

對原包裝小于或等于500g的乳制品，取相同批次的最小零售原包裝，采樣量不小于5倍或5倍以上檢驗單位。

對于原包裝大于500g的乳制品，奶粉及乳清粉采樣時可將潔凈、干燥的采樣鉆沿包裝容器切口方向向下，勻速穿入底部，當(dāng)?shù)竭_(dá)底部時，將采樣鉆旋轉(zhuǎn)180°，抽出采樣鉆并將采集的樣品放入容器內(nèi)。干酪采樣時應(yīng)根據(jù)干酪的形狀和類型，分別使用以下方法采樣：在距邊緣不小于10cm處，將取樣器向干酪中心斜插到一個平面，可進(jìn)行一次或幾次；把取樣器垂直插入一個面，并穿過干酪中心到達(dá)對面；從兩個平面之間，將取樣器水平插入干酪的豎直面，再插向干酪中心；若干酪是裝在桶、箱或其他大容器中，或是將干酪制成壓緊的大塊時，將取樣器從容器頂斜穿到底進(jìn)行采樣。

2）液體樣品

采集液體樣品時，應(yīng)通過振搖使樣品充分混勻，再無菌操作打開包裝，用100mL無菌注射器抽取，然后注入無菌盛樣容器中。

3）罐頭

在檢驗大批罐頭食品時，根據(jù)廠別、商標(biāo)，按品種、來源及生產(chǎn)時間分類進(jìn)行采樣；對于生產(chǎn)過程中的罐頭食品，可按生產(chǎn)班次采樣，每班每個品種取樣基數(shù)不得少于3罐，也可按殺菌鍋采樣，每鍋取1罐，但每批每個品種不得少于3罐；對于儲存的成批罐頭中有變形、膨脹、凹陷、罐壁裂縫、生銹和破損等情況時，可根據(jù)情況決定抽樣數(shù)量。

4）注意事項

（1）采樣的方法是隨機(jī)抽樣，但不等于隨意取樣；

（2）采樣過程必須在無菌條件下進(jìn)行，以防止交叉污染或二次污染，應(yīng)保持樣品原有的微生物狀態(tài)；

（3）采樣前需對采樣工具和容器進(jìn)行消毒；

（4）采樣前后要及時貼上標(biāo)簽，注明樣品名稱、來源、數(shù)量、采樣地點、采樣人及采樣時間等。

2．處理

樣品處理也是檢驗工作中重要的組成部分，如果要根據(jù)一小份樣品的檢驗結(jié)果報告一大批樣品的質(zhì)量，就必須采取正確的樣品制備方法。樣品種類繁多，不同的樣品有不同的處理方法。

1）固體樣品

（1）研磨法。

將一定量的樣品放入無菌研缽中充分研磨后再放入裝有無菌稀釋液的瓶中，蓋緊后充分搖勻。

（2）剪碎法。

將一定量的樣品剪碎后放入裝有無菌水的和玻璃珠的容器中，加蓋后用力快速振搖50次，振幅不小于40cm。

（3）搗碎均質(zhì)法。

將一定的檢樣放入裝有無菌稀釋液的均質(zhì)杯中以8　000～10　000r／min均質(zhì)1～2min，這是大部分樣品都采用的處理方法。

（4）整粒振搖法。

直接稱取25g整粒樣品置于帶有225mL稀釋液和直徑5mm左右玻璃珠的稀釋瓶中，蓋緊瓶蓋，用力快速振搖50次，振幅要大于40cm。

2）液體樣品

（1）原包裝樣品。

在原包裝樣品開口處用75%酒精棉擦拭消毒，用滅菌剪剪開包裝，在剪開部分覆蓋上滅菌紗布或浸有消毒液的紗布，直接吸取樣品25mL，或傾入另一滅菌容器中再取樣25mL檢驗。

（2）含有二氧化碳的液體樣品。

用滅菌開瓶器將瓶蓋啟開，用點燃的酒精棉擦拭瓶口，然后將含有二氧化碳?xì)怏w的樣品倒入500mL磨口瓶內(nèi)，口勿蓋緊，覆蓋一滅菌紗布，輕輕搖蕩，待氣體全部逸出后，取樣25mL檢驗。

3）罐頭

（1）密閉試驗。

將被檢罐頭置于（86±1）℃水浴中，讓罐頭沉入水面以下5cm，然后觀察5min，若發(fā)現(xiàn)有小氣泡連續(xù)上升，則表明漏氣。對玻璃罐頭進(jìn)行試驗時，應(yīng)先浸入溫水中，然后放入上述溫度的水中，以免驟然爆裂。

（2）膨脹試驗。

對于新鮮罐頭，一般在（36±1）℃環(huán)境中放置7天左右，而水果與蔬菜罐頭則在20～25℃環(huán)境中放置7天，然后觀察罐頭蓋頂和底部有無膨脹現(xiàn)象。

（3）取樣待檢。

待檢罐頭均須冷卻至室溫，經(jīng)膨脹試驗發(fā)生胖聽的罐頭應(yīng)先放冰箱使之冷卻。開罐前應(yīng)先將待檢罐頭編號以便于記錄，要在無菌環(huán)境中進(jìn)行。

對于胖聽的罐頭，可用含4%碘的70%酒精消毒，并用滅菌毛巾擦干，不能用點燃的酒精棉球燒灼，以防內(nèi)部氣體受熱而使罐聽膨脹加劇，以致出現(xiàn)裂隙，造成內(nèi)容物噴出。用滅菌的開罐器穿刺罐頂，可設(shè)法收集一些罐內(nèi)氣體，然后通過化學(xué)方法鑒定氣體性質(zhì)，檢驗其是否為二氧化碳、氫氣或其他氣體。之后再無菌采取罐頭中心部位的樣品，取樣量應(yīng)充足以備復(fù)檢之用。

對于外觀正常的罐頭，可用酒精棉球擦去開啟端可能存在的污垢和油漬，再用清潔的毛巾擦干，然后用火焰燒灼開啟端直至所附水分全部蒸發(fā)。用滅菌的開罐器穿刺罐頂，無菌采取罐頭中心部位的樣品，取樣量應(yīng)充足以備復(fù)檢之用。

3．檢驗

采樣后，樣品應(yīng)及時送達(dá)到微生物檢驗室，一般不超過3h，盡量減少樣品存放的時間。送檢過程中，盡可能保持樣品原有的微生物性狀，易變質(zhì)的樣品需冷藏，同時要防止反復(fù)將樣品冷凍和溶解，且送檢的樣品中不得加入防腐劑。微生物檢驗室接到送檢樣品后，應(yīng)立即登記，填寫實驗序號，并按檢驗要求立即將樣品放在冰箱或冰盒中，積極準(zhǔn)備條件進(jìn)行檢驗。

食品衛(wèi)生細(xì)菌學(xué)檢驗包括：細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群和致病菌檢測。

1）細(xì)菌總數(shù)測定

細(xì)菌總數(shù)指食品檢樣經(jīng)處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、需氧性質(zhì)等）培養(yǎng)后，所得1g或1mL食品檢樣（對包裝材料、設(shè)備和工具采用1cm²的表面積）中所含細(xì)菌菌落的總數(shù)，單位記為CFU／g（CFU／mL）。由于一個活細(xì)胞能形成一個菌落，因此，菌落數(shù)就是待測樣品所含的活菌數(shù)。

平板菌落計數(shù)法是最常用的活菌計數(shù)方法。細(xì)菌菌落總數(shù)的測定常采用傾注法，測定的準(zhǔn)確性與操作有很大的關(guān)系，若操作不慎，容易造成人為的誤差，如：樣品在稀釋過程中的誤差；傾倒培養(yǎng)基時由于溫度過高，致使不耐熱的微生物死亡；菌落計數(shù)和報告方式造成的誤差等。

（1）固體和半固體樣品的處理：稱取25g樣品置于裝有225mL生理鹽水的錐形瓶中，放于恒溫振蕩器中振蕩20～30min，或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min，制成1∶10的樣液。

（2）液體樣品的處理：以無菌吸管吸取25mL樣液放于225mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分振蕩搖勻，制成1∶10的樣液。

（3）用1mL無菌吸管吸取1∶10樣液1mL，無菌操作放于裝有9mL無菌生理鹽水的試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)鼓吹使其混合均勻，制成1∶100的樣液。重復(fù)此操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管。

（4）根據(jù)對樣品污染狀況的估計，選擇連續(xù)的3個適宜稀釋度的樣液（液體樣品可包括原液），各吸取1mL于無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個稀釋度做兩個培養(yǎng)皿。同時，分別吸取1 mL空白稀釋液加入兩個無菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對照。

（5）將加熱融化并冷卻至45℃左右的平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于45℃恒溫水浴鍋中保溫）傾注培養(yǎng)皿，并轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿使其混合均勻。

（6）待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)24～48h。

（7）菌落計數(shù)可用肉眼觀察，必要時用放大鏡或菌落計數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)。

選取菌落數(shù)在30～300之間、無蔓延菌落生長的平板計數(shù)菌落總數(shù)。低于30的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300的記錄為多不可計。每個稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個平板的平均數(shù)。其中一個平板有較大片狀菌落生長時不宜采用，應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，可計算半個平板后乘以2，即代表該稀釋度下的菌落數(shù)。

（8）菌落總數(shù)的計算方法。

若只有一個稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)，則計算兩個平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為1g（mL）樣品中菌落總數(shù)。若有兩個連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計數(shù)范圍內(nèi)時，按式（2－1）計算：

式中：N——樣品中菌落數(shù)；

∑C——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

n₁——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；

n₂——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個數(shù)；

d——稀釋因子（第一稀釋度）。

若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數(shù)，其他平板記錄為多不可計，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計算；若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算；若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算；若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在30～300之間，其中一部分小于30或大于300時，則以最接近30或300的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計算。

2）大腸菌群最近似數(shù)測定

大腸菌群指一群在37℃生長時能發(fā)酵乳糖，在24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，因此，可作為食品是否被糞便污染的指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義，據(jù)此可推斷食品中污染腸道致病菌存在可能性的大小。大腸菌群主要是由腸桿菌科中埃希氏菌屬、枸櫞酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬及腸桿菌屬的一些細(xì)菌所組成。食品中大腸菌群是以每100mL（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)（MPN）來表示的。它是按照一定方案檢驗后的統(tǒng)計數(shù)值，是基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。

（1）發(fā)酵試驗。

固體樣品和液體樣品的處理及稀釋度的制備同細(xì)菌總數(shù)測定。

每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），（36±1）℃下培養(yǎng)24h，觀察試管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h，產(chǎn)氣者再進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗，未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。

（2）復(fù)發(fā)酵試驗。

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36℃培養(yǎng)48h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者報告為大腸菌群陽性管。

（3）大腸菌群最可能數(shù)報告。

根據(jù)確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每100g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。

3）常見致病菌檢驗

致病菌指腸道致病菌、致病性球菌等。致病菌的種類很多，食品中致病菌的檢驗主要包括食品原料及食品中各種病原菌的檢驗，如致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、肉毒梭菌及毒素等。而實際檢測中，污染食品的致病菌不是很多，檢測的方法也存在一定的局限性，所以很難將所有的致病菌逐一進(jìn)行檢驗。因此，一般根據(jù)不同食品的特點，選定較有代表性的致病菌作為檢測的重點，并以此來判斷食品中有無致病菌的存在，如蛋粉中將沙門氏菌作為致病菌檢測的對象，酸奶中將致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作為致病菌檢測的對象。

食品中致病菌檢驗通常是采用具有選擇性作用的培養(yǎng)基對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)（若樣品受致病菌污染嚴(yán)重，則可以不經(jīng)增菌培養(yǎng)），然后對培養(yǎng)液進(jìn)行分離培養(yǎng)，根據(jù)分離培養(yǎng)后的菌落生長情況、菌體形態(tài)和生化特性進(jìn)行初步推斷，最后經(jīng)微生物的生理生化試驗、血清凝集試驗及動物試驗等，根據(jù)微生物的形態(tài)特征、生理生化特性、抗原特性動物試驗結(jié)果等判定樣品是否被致病菌污染，并對致病菌微生物進(jìn)行定性和定量分析。以下主要介紹最常見的致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的檢驗技術(shù)。

（1）檢驗大腸桿菌。

大腸桿菌的檢測一般采用伊紅美藍(lán)（EMB）選擇性分離鑒別方法。

增菌：以無菌操作取檢樣25g（mL），放入225mL營養(yǎng)肉湯中，均質(zhì)1min或用研缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，以測定大腸菌群MPN，其余移入500mL廣口瓶內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)6h。無菌操作挑取1環(huán)，接種于30mL腸道菌增菌肉湯內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h。

分離：將陽性的乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)樣液和增菌液分別劃線接種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上；污染嚴(yán)重的檢樣，可將檢樣液直接劃線接種于伊紅美藍(lán)平板上，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h，觀察菌落。

生化實驗：自鑒別平板上直接挑取數(shù)個菌落分別接種到三糖鐵（TSI）瓊脂或克氏雙糖鐵（KI）瓊脂。同時分別接種蛋白胨水、半固體、尿素（pH　7．2）、瓊脂、氰化鉀肉湯和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基，均在36℃培養(yǎng)過夜。

結(jié)果：TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性，氰化鉀陰性和尿素陰性的培養(yǎng)物為大腸桿菌。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、氰化鉀、尿素有任一項為陽性的培養(yǎng)物，均不是大腸桿菌。必要時可做氧化酶試驗和革蘭氏染色鏡檢。

為進(jìn)一步驗證結(jié)果，還可進(jìn)行血清學(xué)試驗或腸毒素試驗。

（2）檢驗金黃色葡萄球菌。

國家標(biāo)準(zhǔn)中，金黃色葡萄球菌的檢測方法是直接計數(shù)法和增菌培養(yǎng)法。直接計數(shù)法屬于定量檢測方法，適用于檢查金黃色葡萄球菌數(shù)不小于10個／g（個／mL）的食品；而增菌培養(yǎng)法屬于定性檢測方法，適用于檢查受損傷的含有金黃色葡萄球菌的加工食品。

①直接計數(shù)方法。

檢樣處理：以無菌操作取檢樣25g（mL），放入225mL滅菌生理鹽水中，恒溫振蕩20～30min，配制成1∶10的混懸液，再進(jìn)行10倍次遞稀釋。

加樣培養(yǎng)：選擇不同濃度的稀釋液1mL，分別加入三塊Baird－Parker平板，每個平板接種量依次為0．3mL、0．3mL、0．4mL，然后用滅菌涂布棒涂滿整個平板。于（36±1）℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)。

接種、檢驗：在上述三個平板上觀察周圍有渾濁帶的黑色菌落，從中任選5個菌落，分別接種于血平板，（36±1）℃培養(yǎng)24h。然后進(jìn)行染色鏡檢和血漿凝固酶試驗。

菌落計數(shù)：將三個平板中疑似金黃色葡萄球菌的黑色菌落數(shù)相加，乘以血漿凝固酶陽性數(shù)，除以5再乘以稀釋倍數(shù)，即可求出每克樣品中金黃色葡萄球菌數(shù)。

②增菌培養(yǎng)法。

檢樣處理：同直接計數(shù)法。

增菌及分離培養(yǎng)：吸取5mL混懸液，接種于裝有50mL　7．5%氯化鈉肉湯或胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，（36±1）℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接種血平板和Baird－Parker平板，（36±1）℃培養(yǎng)24h。挑取血平板上金黃色（少量有白色）菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗。鏡檢后該菌應(yīng)為革蘭氏陽性球菌，排列呈葡萄球狀，無芽孢，無莢膜。培養(yǎng)特性為在肉湯中呈渾濁生長；血平板上菌落呈金黃色，少量有白色，大而突起，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈；在Baird－Parker平板上為圓形、光滑突起，濕潤，顏色呈灰色到黑色，周圍有一渾濁帶，在其外層有一透明圈。

凝固酶試驗：吸取1∶4新鮮兔血漿0．5mL，放入小試管中，再加入培養(yǎng)24h后的金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物0．5mL，振蕩搖勻，置于（36±1）℃恒溫箱或水浴鍋內(nèi)，每半小時觀察一次，連續(xù)觀察6h，若出現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置，此時呈現(xiàn)凝塊者，可認(rèn)為是陽性結(jié)果。同時以已知陽性和陰性葡萄球菌株及肉湯做對照。

結(jié)果若可疑，挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mL腦心浸液肉湯（BHI），（36±1）℃培養(yǎng)18～48h，重復(fù)試驗。

（3）檢驗沙門氏菌。

沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，無莢膜，兼性厭氧，最適生長溫度為37℃。沙門氏菌在普通顯微鏡下和普通培養(yǎng)基中不能與大腸桿菌進(jìn)行區(qū)分，但沙門氏菌不發(fā)酵乳糖及蔗糖，不液化吲哚，在腸道菌鑒別培養(yǎng)基上會形成無色透明菌落，從而可以與大腸桿菌區(qū)別開來。對沙門氏菌的檢驗方法一般包括五個步驟：前增菌，用無選擇性的培養(yǎng)使處于瀕死狀態(tài)的沙門氏菌恢復(fù)活力；選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖，而大多數(shù)其他細(xì)菌受到抑制；選擇性平板分離；生化試驗和血清學(xué)分型鑒定。

前增菌和選擇性增菌：無菌操作取樣25g（mL），加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的廣口瓶內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)4h（干蛋品培養(yǎng)18～24h），移取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18～24h。同時，另取10mL，轉(zhuǎn)種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h。

選擇性平板分離：取增菌液1環(huán)，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個膽鹽硫乳（DHL）瓊脂平板（或HE瓊脂平板、WS瓊脂平板、SS瓊脂平板）。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于（36±1）℃分別培養(yǎng)18～24h，觀察各個平板上生長的菌落情況。

生化試驗：自選擇性瓊脂平板上直接挑取數(shù)個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂。在接種三糖鐵的同時，再接種蛋白胨水（用做吲哚試驗）、尿素瓊脂（pH　7．2）、氰化鉀培養(yǎng)基和賴氨酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基各一管，于（36±1）℃培養(yǎng)18～24h，必要時可延長至48h。

血清學(xué)分型鑒定：

①抗原的準(zhǔn)備。一般采用1．5%瓊脂斜面培養(yǎng)物作為玻片凝集試驗用的抗原。O血清不凝集時，將菌株接種在瓊脂量較高的（如2．5%～3%）培養(yǎng)基上再檢查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O血清凝集反應(yīng)時，可挑取菌苔于1mL生理鹽水中做成濃菌液，于酒精燈火焰上煮沸后再檢查。若H抗原發(fā)育不良，將菌株接種在0．7%～0．8%半固體瓊脂平板的中央，待菌落蔓延生長時，在其邊緣部分取菌檢查；或?qū)⒕晖ㄟ^裝有0．3%～0．4%半固體瓊脂的小玻璃管1～2次，自遠(yuǎn)端取菌培養(yǎng)后再檢查。

②O抗原的鑒定。用A～F多價O血清做玻片凝集試驗，同時用生理鹽水做對照。在生理鹽水中自凝者為粗糙型菌株，不能分型。

③H抗原的鑒定。不常見的菌型，先用163種沙門氏菌因子血清中的8種多價H血清檢查，如有其中一種或兩種血清凝聚，則再用這一種或兩種血清所包括的各種H因子血清逐一檢查，以確定第1相和第2相的H抗原。每一個H抗原成分的最后確定均應(yīng)根據(jù)H單因子血清的檢查結(jié)果，沒有H單因子血清的要用兩個H復(fù)合因子血清進(jìn)行核對。檢出第1相H抗原而未檢出第2相H抗原的，或檢出第2相H抗原而未檢出第1相H抗原的，可在瓊脂斜面上移種1～2代后再檢查。如仍只檢出一個相的H抗原，要用位相變異的方法檢查其另一個相。單相菌不必做位相變異檢查。

菌型的判定和結(jié)果報告：綜合以上生化試驗和血清學(xué)分型鑒定的結(jié)果，按照沙門氏菌屬抗原結(jié)構(gòu)表判定菌型，并報告結(jié)果。