生化黃腐酸抑菌效果的研究

高金崗　何　濱　安飛飛

(海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院熱帶動植物生態(tài)學(xué)省部共建重點實驗室　?？凇?71158)

摘　要：為了研究生化黃腐酸(BFA)對放線菌、酵母菌和桔青霉菌抑菌效果的最適條件，采用了4因素4水平的正交試驗方案。4因素分別為BFA的濃度、培養(yǎng)基的pH值、培養(yǎng)溫度和菌種的生長時期。以抑菌圈的直徑為指標(biāo)，顯示BFA對3種菌的抑菌作用。結(jié)果表明： BFA對3種菌均有抑菌作用，且對放線菌的抑菌效果要好于對酵母菌和桔青霉菌。

關(guān)鍵詞：生化黃腐酸　抑菌圈　抑菌作用　正交試驗

The Study of BFA on Antimicrobial Effects

Gao Jingang,He Bin,An Feifei

(Co-constructing Key Labs by Hainan Province and Ministry of Education for Tropical Animal and Plant Ecology,

School of Life Sciences,Hainan Normal University,Haikou,571158)

Abstract: In order to study the optimal antibacterial conditions of biochemical fulvic acid (BFA)on Actinomycetes,Saccharomyces cerevisiae and Penicillium citrinum,4 factors and 4-level orthogonal test was adopted,in which 4 factors were the concentration of BFA,pH values of medium,incubation temperature and growth period of strains.The diameter of antibacterial zone was selected as an indicator of antibacterial effects and the antibacterial effect of BFA on three bacteria showed that: BFA had　antimicrobial effects on the three bacteria,but the antibacterial effects of BFA on Actinomycetes were　better than that on Saccharomyces cerevisiae and Penicillium citrinum.

Key words: BFA;antibacterial zone;antibacterial effect;orthogonal test

生化黃腐酸(biochemical fulvic acid，簡稱BFA)，是以特定的多種微生物菌株接種到植物培養(yǎng)基中，生成的高純度的腐植酸制劑[1]。經(jīng)過實驗證明，BFA具有消炎、止痛、調(diào)整腸胃功能，提高機(jī)體免疫力等效果[2，3]。但目前對于它的抑菌效果、抑菌機(jī)理、抗菌譜及其作用環(huán)境的研究，國內(nèi)外報導(dǎo)尚少。為了探索BFA對放線菌、酵母菌和桔青霉菌抑菌效果的最適條件，本研究中采用了4因素4水平的正交試驗方案。以抑菌圈的直徑為指標(biāo)，顯示BFA對上述3種菌的抑菌作用，并找出在現(xiàn)有條件下最優(yōu)的試驗條件組合，為今后有關(guān)BFA在抑菌作用方面的試驗研究提供一定的參考和借鑒。

[收稿日期]2015-09-28

[作者簡介]高金崗，男，1957年生，副教授，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事細(xì)胞生物學(xué)和酶組織化學(xué)方面的研究，E-mail：gf6363@ sina.com。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1　藥品

生化黃腐酸購自上海通微生物技術(shù)有限公司，棕褐色粉末，BFA≥95%。

1.1.2　供試菌種

菌種為放線菌(Actinomycetes)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，桔青霉菌(Penicillium citrinum)，均由海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實驗室提供。

1.1.3　培養(yǎng)基

培養(yǎng)基選用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。將其pH值調(diào)為6.0、6.8、7.6和8.4四組，121℃滅菌20min，待用。

1.1.4　主要儀器

722型分光光度計、恒溫?fù)u床、電子分析天平、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.2　方法

1.2.1　正交試驗方案的制定[4]

為了了解生化黃腐酸對所選3種菌種的抑菌作用，選用了生化黃腐酸的濃度、pH值、培養(yǎng)溫度和生長時期4個因素和4個水平的正交試驗。各因素及其水平見表1。不考慮因子間的交互作用，4因素4水平試驗最少需做的試驗次數(shù)=(4-1)×4+1=13，從4n因素正交表中選用試驗次數(shù)稍多于13的正交表安排試驗。因此，選用L16(45)正交表比較合適。含有16個試驗組合的正交試驗方案見表2。

表1　BFA對3種菌抑菌作用正交試驗的因素與水平表
Tab.1 Orthogonal test factor and level table for antibacterial effect of BFA on three common bacteria

表2　BFA抑菌作用的正交試驗方案
Tab.2 Orthogonal test program for antibacterial effect of BFA

1.2.2　菌種生長時期的確定

首先繪制菌種的生長曲線，然后根據(jù)生長曲線來確定菌種生長時期[5]。方法：分別挑取放線菌、酵母菌和桔青霉菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放入恒溫?fù)u床中，37℃振蕩培養(yǎng)(振蕩頻率為250 r/min)；分別在培養(yǎng)2、3、4、6、　8、10、12、14、16、18 h和22 h時取出，放入分光光度計中，在600nm下測定其光密度(OD)。以O(shè)D值為縱軸，以時間為橫軸，繪制菌種的生長曲線。

(1)放線菌生長時期的確定。

根據(jù)不同培養(yǎng)時間繪制的放線菌的生長曲線見圖1。可以看出，在0～4 h時，放線菌的生長處于延滯期，4～8 h處于對數(shù)期，8～14 h處于穩(wěn)定期，14 h后進(jìn)入衰亡期。

圖1　放線菌的生長曲線
Fig.1 The growth curves of actinomycetes

(2)酵母菌生長時期的確定。

根據(jù)不同培養(yǎng)時間繪制的酵母菌的生長曲線見圖2?？梢钥闯?，在0～4 h時，酵母菌的生長處于延滯期，4～11h處于對數(shù)期，11～18 h處于穩(wěn)定期，18 h后進(jìn)入衰亡期。

圖2　酵母菌的生長曲線
Fig.2 The growth curve of saccharomyces cerevisiae

(3)桔青霉菌生長時期的確定。

根據(jù)不同培養(yǎng)時間繪制的桔青霉菌的生長曲線見圖3?？梢钥闯?，在0～4 h時，桔青霉菌的生長處于延滯期，4～10 h處于對數(shù)期，10～18 h處于穩(wěn)定期，18 h后進(jìn)入衰亡期。

圖3　桔青霉菌的生長曲線
Fig.3 The growth curve of penicillium citrinum

由于微生物的生長曲線會受到很多條件的影響，如：菌種的接種量、接種齡、培養(yǎng)基的成分、溫度等環(huán)境因素，因而為了避免試驗的誤差，當(dāng)用分光光度計測得菌種吸光值出現(xiàn)以上4個生長時期的階段特征時，隨即取出，按已設(shè)計的正交表將該階段的菌液涂布在特定pH值的培養(yǎng)基上。

1.2.3抑菌試驗

(1)藥敏紙片的制備[6]。

用口徑為6mm的打孔器將濾紙打成直徑為6mm的小圓紙片，經(jīng)121℃高壓滅菌20min，烘干，隨后分別放入已制備好的各種濃度的BFA中浸泡20min，待用。

(2)采用濾紙片擴(kuò)散法[7]測定抑菌強(qiáng)度。

在超凈工作臺上將滅菌后的培養(yǎng)基倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，每皿15～20mL，待冷卻凝固后，用無菌的移液管吸取菌液滴入平板中，用涂布棒將菌液涂布均勻，然后將浸透過BFA的藥敏紙片，貼在已涂菌液的平板上，每皿貼3片，將培養(yǎng)皿置于特定溫度的恒溫箱培養(yǎng)24 h，用卡尺測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑(D)，依據(jù)抑菌圈直徑(D)的大小判定BFA的抑菌效果。判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑(D)小于6mm為無抑菌作用，抑菌圈直徑(D)等于或大于6mm為有抑菌作用，且抑菌圈的直徑越大，抑菌作用則越強(qiáng)[8]。

2　結(jié)果與分析

2.1　BFA對菌種的抑菌作用

2.1.1　BFA對放線菌的抑菌作用

BFA對放線菌的抑菌作用的正交試驗結(jié)果顯示(表3)：16個組合抑菌圈的平均直徑均大于6mm，表明BFA對所有組合均有抑菌作用，且當(dāng)BFA的濃度取1水平(75mg/mL)、pH值取4水平(9.2)、溫度取4水平(37℃)、生長時期取4水平(衰亡期)組合時，抑菌圈的平均直徑最大(D=30mm)，抑菌效果最好。根據(jù)各因素各水平平均數(shù)的最大極差可以看出溫度的極差最大，為15.64；pH值稍次，為14.48；生長時期的極差為11.74；濃度的極差最小，為9.14，表明溫度和pH值是影響抑菌圈直徑的關(guān)鍵因子。

表3　放線菌的正交試驗結(jié)果及分析
Tab.3 Orthogonal experiment results and analysis of actinomycetes

注：T1、T2、T3、T4分別為各影響因素不同水平的總和；X1、X2、X3、X4分別為各因素各水平的平均數(shù)；Rmax為各因素各水平的最大極差值。下同。

2.1.2　BFA對酵母菌的抑菌作用

BFA對酵母菌抑菌作用的正交試驗結(jié)果顯示(表4)：16個組合抑菌圈的平均直徑均大于6mm，表明BFA對所有組合均有抑菌作用，且當(dāng)BFA的濃度取2水平(80mg/mL)、pH值取2水平(5.2)、溫度取4水平(37℃)、生長時期取3水平(穩(wěn)定期)組合時，抑菌圈的平均直徑最大(D=9.8mm)，抑菌效果最好。根據(jù)各因素各水平平均數(shù)的最大極差可以看出：溫度的極差最大，為7.30；pH值稍次，為7.26；濃度的極差為6.95；生長時期的極差為6.63，表明溫度和pH值是影響抑菌圈直徑的關(guān)鍵因子。

表4　酵母菌的正交試驗結(jié)果及分析
Tab.4 Orthogonal experiment results and analysis of saccharomyces cerevisiae

2.1.3　BFA對桔青霉菌的抑菌作用

BFA對桔青霉菌抑菌作用的正交試驗結(jié)果顯示(表5)：16個組合抑菌圈的平均直徑均大于6mm，表明BFA對所有組合均有抑菌作用，且當(dāng)BFA的濃度取1水平(75mg/mL)、pH值取3水平(6.0)、溫度取3水平(30℃)、生長時期取3水平(穩(wěn)定期)組合時，抑菌圈的平均直徑最大(D=9.8mm)，抑菌效果最好。根據(jù)各因素各水平平均數(shù)的最大極差可以看出溫度的極差最大，為7.50；生長時期次之，為7.15；pH值的極差為7.03；濃度的極差值最小，僅為6.53，說明溫度是影響抑菌圈直徑的關(guān)鍵因子。

表5　桔青霉菌的正交試驗結(jié)果及分析
Tab.5 Orthogonal experiment results and analysis of penicillium citrinum

3　結(jié)論與討論

放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)大的原核生物，革蘭氏染色多呈陽性，由于與細(xì)菌十分接近，被認(rèn)為是一類革蘭氏陽性細(xì)菌；酵母菌和桔青霉菌均屬于真菌，是一類真核微生物。

試驗結(jié)果顯示，BFA對試驗中所選的3種菌(放線菌、酵母菌和桔青霉菌)均有抑制作用。BFA對放線菌的抑菌效果最為明顯(D=30mm)，明顯大于對酵母菌和桔青霉菌的抑菌效果(D均為9.8mm)。這可能是因為放線菌和真菌的細(xì)胞壁的化學(xué)成分有明顯的不同所致。放線菌是一類革蘭氏陽性細(xì)菌，其細(xì)胞壁的主要成分是肽聚糖和磷璧酸，酵母菌細(xì)胞壁的主要成分為“酵母纖維素”，桔青霉菌細(xì)胞壁的主要成分為幾丁質(zhì)[9]。試驗結(jié)果表明，BFA可能對放線菌細(xì)胞壁的化學(xué)成分肽聚糖或者是磷璧酸更加敏感。至于BFA是如何作用于細(xì)胞壁上的肽聚糖或磷璧酸而產(chǎn)生抑菌效果的，還有待進(jìn)一步研究。

放線菌有極強(qiáng)的分解纖維素、石蠟、角蛋白、瓊脂和橡膠等的能力，因此，在環(huán)境保護(hù)，提高土壤肥力等方面起著重要作用。近年在農(nóng)業(yè)上，BFA作為添加劑不僅廣泛應(yīng)用于化學(xué)肥料的改良，也開始應(yīng)用于有機(jī)肥的改良，這極大地增強(qiáng)有機(jī)肥的肥效[10]。本試驗中，BFA對放線菌有明顯的抑制作用(D=30mm),因此，BFA作為有機(jī)肥增效劑使用時，還應(yīng)考慮其對放線菌的影響，合理使用，以有益于土壤的改良。

細(xì)菌和真菌均易受外界環(huán)境因素的影響，各環(huán)境因子的改變都會在一定程度上影響到它們的生長或代謝，這便給研究BFA抑菌作用的環(huán)境問題帶來了困難。本試驗選用的正交試驗法則為解決此問題提供了一種有效方法。應(yīng)用正交試驗方法可以找到最優(yōu)試驗條件組合以及影響B(tài)FA抑菌效果的關(guān)鍵因子。如本試驗找到放線菌最優(yōu)實驗條件組合：既當(dāng)BFA的濃度取1水平(75mg/mL)、pH值取4水平(9.2)、溫度取4水平(37℃)、生長時期取4水平(衰亡期)組合時，抑菌圈的平均直徑最大(D=30mm)，抑菌效果最佳。數(shù)據(jù)經(jīng)極差分析后結(jié)果還顯示：溫度的極差最大，為15.64；pH值稍次，為14.48；生長時期為11.74；濃度最小，為9.14。表明本實驗中，溫度和pH值是影響B(tài)FA抑菌效果的關(guān)鍵因子。

有關(guān)BFA的抑菌機(jī)理、抗菌譜以及最佳的作用環(huán)境等方面，還有待深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1]汪善鋒，汪海峰，陳安國，等.生化黃腐酸的應(yīng)用效果與作用機(jī)理[J].中國飼料，2004，(22)：12～13

[2]馬慶凱，王虹.黃腐酸鈉灌腸治療慢性非特異性結(jié)腸炎180例[J].中國冶金工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2002，19(5)：285～286

[3]李紅玉.生化黃腐酸在畜牧業(yè)中的應(yīng)用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33(2)：18～19

[4]李春喜，邵云，姜麗娜.生物統(tǒng)計學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2008：189～197

[5]沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2007：85～88

[6]沈關(guān)心.微生物學(xué)與免疫學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：310～311

[7]呂平，黃強(qiáng).苦丁茶不同提取物的體外抑菌作用研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(34)：16838～16840

[8]吳國娟，張中文，李煥榮，等.中草藥對奶牛乳腺炎6種致病菌的抑菌效果觀察[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2003，18(3)：195～198

[9]周德慶.微生物學(xué)教程[M].北京：高等教育出版社，2011：54～59

[10]李瑞波.生物腐植酸與生態(tài)農(nóng)業(yè)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：76～82