研究案例_基因探秘

8.6 研究案例

無患子提取物對模式動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響研究

陳忻昀　賀博文

（同濟大學第二附屬中學，上海，200060）

摘要：課題的主要目的是研究無患子果皮乙醇粗提物對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響。通過每天對小鼠灌胃無患子粗提物（50、100、200、250、300、350、400mg/kg的劑量），連續(xù)15天后觀察記錄小鼠的各種神經(jīng)系統(tǒng)反應，包括：一般行為模式（自發(fā)行為、警覺、聽覺、觸覺、痛覺等）、安定誘導的催眠效應以及探洞行為。結果顯示無患子乙醇粗提物極大地降低了小鼠一般行為和探洞行為，加劇了安定誘導的催眠效應。因此初步確定無患子粗提物對小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜抑制作用。

關鍵詞：無患子　安定　中樞神經(jīng)系統(tǒng)　小鼠

1　研究背景及意義

無患子（Sapindus emarginatus Vahl）也稱為肥皂樹或洗手果，為無患子科無患子屬的一種落葉喬木，在東南亞各國、我國臺灣省及淮河以南各省均有分布[3]。無患子屬植物具有極大的藥用價值。藥理研究表明，無患子果皮所含皂苷成分具有抗皮膚真菌和念珠菌作用、抑制腫瘤細胞增殖、抗幽門螺旋桿菌活性、保肝作用等多種生物活性[2]。無患子的假種皮中富含皂苷[1]，具有良好的起泡性和去污性能，可作為天然活性物質(zhì)用于洗發(fā)香波及各種潔膚護膚化妝品中；它還具有抗菌和止癢等生理功效，可用于腳癬和輪癬的治療[4]。

2　材料與方法

2.1　無患子粗提物

無患子采自同濟大學校園內(nèi)的無患子樹上自然成熟的無患子果實。取無患子果皮用食品粉碎機打碎（如圖1A所示），過50目不銹鋼篩后，將粉末放入500mL廣口瓶中，加入1 ：5料液比的乙醇浸泡（如圖1B所示），浸泡時間為3天。期間每天一次將乙醇提取液用兩層濾紙過濾后加入新的乙醇繼續(xù)提取（如圖1C所示）。乙醇提取液合并。在45 ℃下濃縮至無乙醇，合并濃縮物（如圖1D所示）。稱 重。

圖1　無患子提取過程

2.2　供試動物

使用動物為小白鼠（由中科院上海細胞與生化研究所提供）。小白鼠分組飼養(yǎng)于塑料籠子（38 cm×23 cm×10 cm）內(nèi)，每個籠子內(nèi)白鼠數(shù)量不多于8個，并置于標準實驗室（25±2 ℃）及晝夜交替（14/10小時）條件下生長，小鼠可以自由取食和飲水。小鼠在實驗室適應環(huán)境兩周后開始實 驗。

2.3　其他供試藥物

本試驗需要的其他藥物有：安定。

2.4　急性毒性研究

選22～25 g重的小鼠并隨機分組。小鼠斷食過夜，只供應水。通過灌胃法口服50、200、400mg/kg的無患子粗提液5天并觀察5天。如果在6只供試小鼠中有2～3只死亡說明處理劑量為有毒劑量。如果僅有一只小鼠死亡，同劑量重復后確定有毒劑量。如果沒有死亡發(fā)生，則提高劑量如50、300、2000mg/kg重復試驗。在處理72小時內(nèi)觀察小鼠的中毒癥狀，如行為改變、移動、抽搐及死亡。

圖2　無患子提取物不同濃度配制及小鼠灌胃實驗

2.5　行為模式觀察

46只小鼠分為9組，每組5～8只，灌胃前小鼠稱重，取平均體重。前7組小鼠分別口服50、100、200、250、300、350和400mg/kg的無患子提取物（分別對應3、6、12、15、18、21、24mg/mL的提取物濃度，每只小鼠灌胃0.5mL）及水灌胃作為對照處理15天。最后一組在處理的最后一天灌胃5mL/kg的安定作為藥物處理對照。然后在第一個小時每半個小時一次，接下來4個小時每小時一次對小鼠進行如下行為的觀 察。

2.5.1　意識、警覺以及自發(fā)活動

通過將小鼠放置在另外一個體位，觀察它們能夠調(diào)整自身回復原來體位而不發(fā)生碰撞或跌倒的能力，記錄它們的意識和警覺變化。在正常休息體位則記為（－），微小活動為（＋），中度移動為（＋＋），強烈反應為（＋＋＋），異常不安定為（＋＋＋＋）。將小鼠放置在一個鐘形容器中所表現(xiàn)的輕微的好奇行為則為自發(fā)活動。輕微活動記為（＋＋），劇烈活動為（＋＋＋），幾乎沒有移動為（＋），進入睡眠狀態(tài)則為（－）。如果變現(xiàn)為持續(xù)的走或跑等極度或很強的好奇活動則為（＋＋＋＋）。然后將小鼠從容器中取出放在桌子上，重復以上觀察并記錄小鼠行為。

2.5.2　正位反射：處理后分別在15、30和60分鐘后輕輕地將小鼠背部朝下放置在一個有凹槽的表面，并保持溫度在30 ℃。如果小鼠保持背朝下姿勢30 s，說明它不具有正位反射的能力。

2.5.3　耳廓反射：使用一根毛發(fā)或其他細微的工具碰觸小鼠耳廓中部觀察它們的反射能力。不受影響的小鼠會自發(fā)地躲避碰觸物。

2.5.4　握力：握力測試用于評價嚙齒類動物的肌肉力量或神經(jīng)肌肉的功能。通過讓動物抓住一支水平放置的鉛筆，然后記錄動物握筆至鉛筆掉落至桌面上的時間。

2.5.5　觸覺：通過用鉛筆或鑷子觸碰小鼠身體的各個部位（如頸側、腹部以及腹股溝等部位），觀察記錄小鼠的反應。

2.5.6　痛覺：用一個小的動脈鉗夾住小鼠尾巴的基部，記錄反應。

2.5.7　聽覺：小鼠通常習慣安靜條件，因此任何響動都會對小鼠產(chǎn)生不良的刺激。

以上測試用于研究不同濃度的無患子提取物對小鼠中樞神經(jīng)的鎮(zhèn)靜作用。鎮(zhèn)靜作用記錄為無效（－），微效（＋），中效（＋＋），強效（＋＋＋），超效（＋＋＋＋）。

2.6　苯安定誘導的睡眠時間

供試小鼠被分成4組，8個一組，分別用無患子提取物50、100、200mg/kg及0.5mL的水處理15天后，灌胃40mg/kg的安定30分鐘后開始記錄睡眠時間以及小鼠失去或回復正位反射功能的間隔時間。

2.7　探索行為：洞板實驗

該實驗是基于小鼠喜歡探洞的天性設計的，它能有效反映小鼠對新環(huán)境的好奇心。五組小鼠，每組8只，分別用50、100、200mg/kg的無患子粗提物、水以及5mg/kg的安定處理30分鐘后，將小鼠放置在相同大小和間隔的16孔木板上，3分鐘內(nèi)記錄每只小鼠的探洞次數(shù)。

3　結果與分析

3.1　急性毒性研究

小鼠斷食過夜，只供應水。通過胃插管法口服50、200和400mg/kg的無患子粗提液5天，并觀察5天。發(fā)現(xiàn)400mg/kg的處理下，小鼠有抽搐和死亡的現(xiàn)象。最初每只小鼠灌胃1mL，因為技術不熟練，插入氣管導致幾只小鼠死亡，還有幾只可能因灌胃量太大出現(xiàn)抽搐甚至死亡，因此確定灌胃量為0.5mL。在后續(xù)實驗中以400mg/kg為最高處理濃度，并相應的增加幾個濃度梯度。在后來的實驗中，隨著灌胃技術的熟練，甚至在400mg/kg的劑量下也未發(fā)生死亡現(xiàn)象。部分粗提物處理小鼠在連續(xù)灌胃后5天出現(xiàn)干嘔和類似打嗝的癥狀，并且處理劑量越高，癥狀越明顯，但沒有出現(xiàn)死亡。

3.2　行為模式觀察

無患子粗提物對小鼠一般行為模式的鎮(zhèn)靜作用列于表1。從統(tǒng)計結果可以看出200mg/kg的粗提物對小鼠的一般行為模式均有一定的鎮(zhèn)靜抑制作用，相比較而言安定對所有的行為均有很強的鎮(zhèn)靜抑制作用。

表1　無患子乙醇粗提物對小鼠一般行為模式的鎮(zhèn)靜效應

注：鎮(zhèn)靜作用記錄為無效（－），微效（＋），中效（＋＋），強效（＋＋＋），超效（＋＋＋＋）。

3.3　安定誘導的睡眠時間

從表2的結果可以看出，無患子乙醇粗提物極大地加強了安眠藥對小鼠的催眠效應，并且這種增強隨著處理濃度的增加而增加。

表2　無患子粗提物對安定誘導的小鼠睡眠時間的影響

3.4　探洞行為：洞板實驗

從表3的結果可以看出，無患子粗提物處理后小鼠的探洞行為明顯降低，并且濃度越高降低越明顯。

表3　無患子粗提物對小鼠探洞行為的影響

注：探洞行為為3分鐘的記錄結果。

4　結論與討論

我們利用乙醇提取無患子果皮中的皂苷，并研究了粗提物對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用。結果顯示無患子乙醇粗提物影響了小鼠的自發(fā)活動、正位反應、耳廓反應、握力以及痛感等一般行為模式。小鼠的意識降低和抑郁行為可能是由于無患子粗提物對中樞神經(jīng)的作用。耳廓反射能力的降低可能是由于阻斷了神經(jīng)傳遞途徑中突觸的形成。以前有研究證明了無患子對小鼠沒有毒性，但是我們在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，400mg/kg的處理濃度下有3只小鼠在灌胃1周后的10天內(nèi)陸續(xù)死亡，我們在咨詢了華師大的陳邦林老師后得知無患子粗提物中可能含有大量的鞣酸，口服對胃黏膜有刺激性，可引起惡心、嘔吐；用于局部破損處，如大面積燒傷或用硫酸鋇灌腸劑灌腸時，易吸收中毒，引起肝臟嚴重毒性，甚至死亡。這也解釋了我們在給小鼠灌胃后，小鼠出現(xiàn)惡心干嘔的現(xiàn)象，并且濃度越高這種癥狀越嚴 重。

不同濃度的無患子粗提物處理小鼠后發(fā)現(xiàn)，隨著處理濃度的提高，極大地增加了安眠藥的催眠效應，說明無患子提取物具有鎮(zhèn)靜活性。同時，與對照組相比，處理組小鼠的探洞行為明顯減少，也說明了粗提物對中樞神經(jīng)具有抑制作用。

中國古代各種醫(yī)籍對無患子的清洗、醫(yī)療作用也作詳細的記載。明代大醫(yī)學家李時珍所著的《本草綱目》，尤為詳細記載無患子的各種藥用價值，指出無患子用于洗面可增白，去斑，也可去風明目，去口臭。無患子的種仁也是一種藥材，又叫中仁。而印度的草藥醫(yī)師則用其種仁油治療偏頭痛等各種頑疾，子皮研后納入喉中，可治療咽喉腫痹。無患子類醫(yī)藥產(chǎn)品開發(fā)前景廣闊。已有報道無患子含有三萜系化合物以及皂苷。大量科學報道說明三萜系化合物具有中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜劑的作用。因此存在無患子甲醇粗提物中的這些有效成分可能作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但是，在無患子提取物中究竟是哪一種植物成分對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有作用還不知道，同時動物中作用受體也未知，因此未來研究可以著重于這兩方 面。

參考文獻

［1］朱亞紅，吳珉，胡秀卿，平立風，徐玲英.無患子皂苷粗提物提取方法比較［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學，2008，2：247—248。

［2］黃素梅，王敬文，杜孟浩，張金萍，姜景民.無患子的研究現(xiàn)狀及其開發(fā)利用［J］.林業(yè)科技開發(fā)，2009，23，（6）：1—5。

［3］吳征鎰，陳書坤，李錫文，等.云南植物志1卷［M］.北京：科學出版社，1979.

［4］黃彥勛.神奇天然肥皂——無患子［J］.現(xiàn)代中醫(yī)藥（北京），2006，2：54—56.

黑豆皮中黑色素抗氧化性研究

包　瀛

（同濟大學第二附屬中學，上海，200060）

摘要：隨著生活水平的提高，人們對營養(yǎng)的要求也越來越高。同時黑色食品正作為新一代健康食品越來越受到青睞。本試驗對黑豆皮中的黑色素進行粗提后，通過黑豆皮黑色素的總抗氧化能力及清除DPPH自由基活性的測定對黑豆皮黑色素的抗氧化能力進行研究，經(jīng)試驗測得黑豆皮黑色素具有很強的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力。同時將粗提物飼喂親本果蠅后觀察黑豆皮黑色素提取物對子一代果蠅的繁殖及子二代果蠅的生長發(fā)育的影響。初步試驗結果表明黑色素飼喂親本果蠅后，能加快子二代果蠅幼蟲的化蛹過程及增加子二代果蠅幼蟲化蛹及隨后羽化為成蟲的數(shù)量。黑豆皮黑色素提取物飼喂果蠅后明顯上調(diào)了果蠅體內(nèi)自由基清除基因SOD1、SOD2及CAT的表達和抑制了長壽負調(diào)控基因MTH的表達。

關鍵詞：黑豆皮　黑色素　抗氧化　果蠅　生長發(fā)育

1　研究背景及意義

隨著人們生活水平的增長，人們對營養(yǎng)的要求不斷提高，選擇食品的著眼點已經(jīng)從溫飽型轉向保健型。近年來，黑色食品作為新一代具有高營養(yǎng)價值和保健功效的健康食品進入人們的視線，常見的有黑豆、黑米、黑麥、黑芝麻、黑玉米、黑木耳、紫菜、海帶等。

有研究表明，食物的營養(yǎng)品質(zhì)與其種皮或果皮的天然顏色密切相關，一般來說食物的顏色愈深其營養(yǎng)價值愈高，且結構越平衡合理，其排列依次為黑、綠、紅、黃、白，在同類食物中情況更加明顯，如紅薯優(yōu)于白薯，黑米優(yōu)于紅米，黑豆優(yōu)于黃豆等［1］。黑色食品之所以會有保健作用，是由于它們本身所含有的黑色素。黑色素是一種廣泛存在于動植物和微生物中的非均質(zhì)的類多酚聚合體。黑色素不是一種物質(zhì)，而是有相同性質(zhì)的一大類物質(zhì)［2］，且黑色食品中的天然色素一般集中在其種皮或果皮上。

黑豆又稱黑大豆，是種皮為黑色的特殊類型的豆科植物，不僅營養(yǎng)豐富，而且藥用價值較高，黑豆富含人體所需的18種氨基酸，其中包括8類必需氨基酸，含量高于黃豆；同時這也是其他黑色谷物所不能比擬的。在眾多黑色食品中，黑豆算得上是佼佼者，其膳食纖維含量高出黑米約1倍。黑豆中所含黃酮及類黃酮化合物的量更是高于普通大豆5～7倍，且鋅、銅、鎂、鉬、硒、磷等微量元素，維生素（其中E族和B族維生素含量最高，維生素E的含量比肉類高5～7倍），脂肪（以不飽和脂肪酸為主）以及粗纖維含量相當豐富［3、4］，黑豆皮所含的黑色素具有很好的抗氧化作 用。

除了抗氧化和防止衰老等功能外，天然黑色素也可應用于食品工業(yè)中，如飲料、糕點、巧克力、果醬等，以替代人工添加劑；在化學工業(yè)上，作為合成黑色素的換代產(chǎn)品，也可替代黑發(fā)劑、防曬霜等。因此，將黑色食品中的黑色素更多更高效地提取出來并將其抗氧化作用更廣泛地應用于人們的日常生活中，相信會對提高人類健康水平作出貢獻。

生物衰老部分由于機體細胞長期產(chǎn)生游離自由基。正常細胞氧化代謝產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）也就是羥基自由基、超氧負離子和過氧化氫。普遍認為衰老是由于機體抗氧化能力下降所致。因此，機體自身具有兩種抗氧化系統(tǒng)來清除活性氧，一種是機體自身產(chǎn)生一組包括過氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）以及過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶作為抗氧化的第一道屏障；另一種是外源攝入抗氧化物質(zhì)，如維生素E和維生素C，這些物質(zhì)可以作為第二道防御屏障來終止活性氧化反應，延遲衰老進程［5］。已有報道稱MTH（methuselah）基因是一種決定長壽負調(diào)控的基因，研究表明MTH突變體果蠅比野生型果蠅長壽35%并且表現(xiàn)很強的抗氧化能力，但這一機理仍然未知［6］。

果蠅作為一種研究衰老的模式動物，因為其與人類一樣有許多保守的生理途徑和70%以上的已知致病基因［7］。另外，由于生命周期短，體小易操作，并且已知全基因組序列，因此果蠅作為衰老模式動物來研究有很多好處。人們普遍認為通過改善飲食可以延長壽命延緩衰老。一方面許多通過模式動物的研究表明限制熱量的攝入可以延長壽命［6］；另一方面，日常營養(yǎng)保健品的補充攝入也被認為可以延緩衰老［8］。在眾多黑色食品中，學者對黑米、黑芝麻的研究頗多，而其他黑色食品（尤其是黑豆）相對比較冷門，而且現(xiàn)代人們對黑米、黑芝麻、黑木耳的食用非常多，對黑豆的了解與接觸略少，故本文以黑豆皮為材料，對其黑色素粗提物清除DPPH自由基等抗氧化活性進行研究與分析，通過飼喂果蠅來研究其抗衰老功能，讓黑豆也能和黑米、黑芝麻一樣成為人們健康食品的首選。

2　實驗儀器及材料

2.1　實驗儀器

紫外分光光度計、研缽、恒溫水浴鍋、電子天平、漏斗、50目藥篩、25mL容量瓶、100mL容量瓶、燒杯、滴管、冷凝管、圓底燒瓶、酒精燈、石棉網(wǎng)、鐵架臺、鐵夾、烘箱、量筒、pH試紙、錐形 瓶。

2.2　實驗材料

黑豆（市售）、DPPH（二苯代苦味酰肼）（化學純）、無水乙醇（分析純）、鹽酸、蒸餾水、鹽酸、鎂粉、果蠅、氫氧化鈉、乙醚，總抗氧化能力（T—AOC）測定試劑盒（中科院生化研究所提 供）。

3　實驗方法

3.1　黑豆皮黑豆色素的提取

剝?nèi)『诙蛊ず娓珊笥谘欣徶醒心ズ筮^50目篩（如圖1A所示），稱取1 g過篩后的粉末置于錐形瓶中，以1 ：20（g ：mL）加入20mL 60%乙醇（pH2.0）60 ℃下進行4次（每次1小時）的抽提（如圖1B所示），經(jīng)兩層濾紙過濾后合并4次抽提液于60 ℃揮發(fā)去除乙醇，得到黑色素的粗提物粉末，最后配成100mg/mL、250mg/mL及300mg/mL的終濃度，于4 ℃避光保存。其總的提取流程為：黑豆皮、干燥、粉碎、浸提、過濾、定容、得黑豆色素、定容。

圖1　黑豆皮黑色素提取

3.2　黑豆皮色素總黃酮的鑒定

用鹽酸—鎂粉還原反應進行定性分析，對黑豆皮色素提取物是否為黃酮類物質(zhì)進行初步鑒別。取黑豆皮黑色素提取液，加入少量的鹽酸和鎂粉，在試管中加熱振搖片刻，觀察提取液的顏色變化。黃酮類化合物中，黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇類顯橙紅至紫紅色，部分顯紫色至藍色，其他黃酮類化合物，除少數(shù)異黃酮外，都不顯色。

鹽酸—鎂粉反應中，多數(shù)黃酮、黃酮醇、二氫黃酮及二氫黃酮醇化合物顯橙紅至紫紅色，少數(shù)顯紫色至藍色。異黃酮類一般不顯色。

3.3　黑豆皮黑色素總抗氧化能力測定

利用黑豆皮黑色素的抗氧化性，使Fe3＋還原成Fe2＋，后者可與菲啉類物質(zhì)形成穩(wěn)定的配合物，通過比色可以測出其抗氧化能力的高 低。

采用已確定的最佳提取條件對0.25 g黑豆表皮碎屑進行恒溫水浴提取，將提取液定容至25mL容量瓶（提取液黑豆皮濃度為：10mg/mL）。按照總抗氧化能力測定試劑盒規(guī)定的步驟說明進行總抗氧化能力測定，按表1滴加試劑（試劑二配制：每支粉劑加蒸餾水120mL充分溶解；試劑三應用液配制：用試劑三黃色儲配液與稀釋液以1 ：19比例稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配）。

表1　總抗氧化能力測定試劑表

混勻后放置10分鐘，蒸餾水調(diào)零1 cm光徑，于520 nm下測定各管吸光度。根據(jù)以下公式計算總抗氧化能 力：

ODu——測定管吸光度值；

ODc——對照管吸光度值；

N——反應體系稀釋倍數(shù)（反應液總體積/提取液體積）。

3.4　黑豆皮黑色素對DPPH自由基的清除試驗

稱取DPPH 0.0120 g，用無水乙醇充分溶解并定容至25mL容量瓶，得到濃度2×10－3mol/L的DPPH乙醇溶液，使用時稀釋20倍。

采用已確定的最佳提取條件1 g黑豆皮碎屑進行恒溫水浴提取，并將提取液定容至100mL容量瓶（提取液黑豆皮濃度為：10mg/mL）。分別將提取液稀釋0倍（10mg/mL）、1倍（5mg/mL）、2倍（10/3mg/mL）、3倍（2.5mg/mL）、4倍（2mg/mL），每種濃度提取液取0.1mL于5支試管中，分別每管加入濃度1×10－4mol/L的DPPH乙醇溶液3.9mL，混勻后靜置30分鐘，于517 nm下以無水乙醇為空白對照測其吸光度值，并按以下公式計算黑豆皮黑色素對DPPH自由基的清除率：

其中ODu表示3.9mL DPPH乙醇溶液與0.1mL提取液的混合液的吸光度值，ODo表示3.9mL蒸餾水與0.1mL提取液的混合液的吸光度值，ODc表示3.9mL DPPH乙醇溶液與0.1mL蒸餾水的吸光度值（對照管）。

3.5　黑豆皮色素對果蠅生長周期的影響

將黑豆皮黑色素粗提物稀釋后加入果蠅培養(yǎng)基，濃度分別為2、10、15、20、30、40、80mg/mL，并設置空白對照（如圖1C所示）。培養(yǎng)基厚度為1～2 cm，備用（如圖1D所 示）。

25 ℃下，將獲得的果蠅卵每10只放入一支試管內(nèi)，每個濃度3支試管（若果蠅羽化后，有試管為全部雌性或全部雄性，可做少許調(diào)整，使用乙醚麻醉，讓每支試管內(nèi)雌雄比例恰當）。當看到有子一代幼蟲爬出時，就要轉移出親代果蠅，新羽化的成蟲（雌蟲為處女蠅）用于下一批實驗。

重新配制一批相同濃度梯度試管，重復3支，從上述試管中新羽化的成蟲中分別挑取兩只雄蟲和兩只雌蟲（雌蟲為處女蠅）接入新配制的相應濃度的試管中，使其自然交配產(chǎn)卵，5天后去除成蠅。觀察幼蟲化蛹、羽化以及成蟲的壽命。然后可繼續(xù)觀察子一代產(chǎn)卵時間、羽化時間、壽命、子二代孵化時間等。

3.6　基因表達檢測

根據(jù)初步實驗結果，選取對照處理和40mg/mL的黑豆皮粗提物處理的果蠅分別在0、15、30、50天時取20只果蠅提取總RNA。將果蠅（n＝20）于800 μL TRIzol（Invitrogen）中充分研磨，4度12000 g離心10分鐘。將上層清液轉移至新離心管中，加入160 μL氯仿，并充分混勻，4度12000 g離心15分鐘。轉移上層清液，加入400 μL異丙醇。室溫放置10分鐘，4度12000 g離心10分鐘，沉淀用1mL 75%的乙醇洗滌后離心，倒掉乙醇。最后用25 μL DEPC處理水溶解RNA。使用分光光度計在260 μm和280 μm測量RNA的純度和濃度。使用商業(yè)化的cDNA反轉錄試劑盒按說明書要求合成cDNA，并儲存于－20 ℃。

檢測的基因包括SOD1（NCBI登錄號NM_057387.3）、SOD2（NCBI登錄號NM_057577.2）、CAT（NCBI登錄號NM_080483.2）、MTH（NCBI登錄號NM_079147.2），根據(jù)序列合成引物?；虮磉_的最終數(shù)據(jù)是根據(jù)果蠅組成性看家基因rp49作為內(nèi)參計算后獲得的。

4　結果

4.1　黑豆皮黑色素提取

黑豆皮黑色素經(jīng)60%乙醇抽提后，最后用蒸餾水溶解后至終濃度100、250和300mg/mL（如圖2所示），儲存于4 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?。高濃度的黑色素提取液為深紫色，低濃度提取液為淡黃 色。

鹽酸—鎂粉反應中，溶液明顯變深紫色，并可見少許藍色反應，可初步推斷提取液中含有黃酮類。

圖2　黑豆皮黑色素粗提物

4.2　黑豆皮黑色素總抗氧化能力測定

對不同濃度黑豆皮提取液的總抗氧化能力進行測定，試驗結果見表2。

表2　不同濃度黑豆皮黑色素的總抗氧化能力

由表2可看出，黑豆皮黑色素的總抗氧化能力隨著提取液濃度的增加有上升趨勢，對這兩組數(shù)據(jù)進行相關性分析，得到總抗氧化能力與提取液濃度的相關系數(shù)為0.9998，說明兩者具有極高的相關性。

4.3 黑豆皮黑色素對DPPH自由基的清除試驗

對不同濃度黑豆皮提取液清除DPPH自由基活性進行研究，試驗結果見表3。

表3　黑豆皮黑色素對DPPH自由基的清除率

由表3可看出，隨著提取液濃度的升高清除率呈明顯上升趨勢，不同提取液濃度之間清除率存在極顯著差異（P＜0.01）。當提取液的濃度為2.50mg/mL時，黑豆皮黑色素對DPPH自由基的清除率就已超過50%。

4.4　黑豆皮色素對果蠅生長周期的影響

將黑豆皮黑色素粗提物稀釋后加入果蠅培養(yǎng)基，配成不同濃度梯度的提取物培養(yǎng)基飼喂果蠅成蟲，并取子一代果蠅在同一處理下自然繁殖后觀察子一代成蟲產(chǎn)卵情況以及子二代幼蟲化蛹、羽化情況和生長周期的長短。

果蠅的生活周期包括：卵→一齡幼蟲→二齡幼蟲→三齡幼蟲→蛹→成蠅。三齡幼蟲成熟后會爬到試管壁上化蛹，然后羽化為成蠅。初步試驗發(fā)現(xiàn)，加入黑色素提取物的處理管中，幼蟲化蛹時間明顯提前，并隨著濃度的升高幼蟲化蛹數(shù)量明顯增加，并且在第24天后羽化成蟲數(shù)量明顯增多（如圖3和表4所示）。

表4　黑豆提取物飼喂果蠅后對子一代化蛹和羽化發(fā)育的影響

圖3　不同處理子一代果蠅產(chǎn)卵后6天幼蟲化蛹比較

4.5　基因表達

從RT-qPCR（如圖4所示）的基因表達結果可以看出，同對照處理相比，黑豆提取物飼喂果蠅15天后SOD1基因被極大地上調(diào)表達，而SOD2和CAT基因在處理50天才被上調(diào)表達；MTH基因在提取物處理30天后同對照處理相比有明顯的下調(diào)表達。

由此說明，黑豆皮粗提物能有效地誘導自由基清除基因的表達，并且抑制長壽負調(diào)控基因MTH的表達。

5　討論

目前制取黑色素一般有兩種方法，一是從糧食種皮如黑豆、黑芝麻、黑麥等或者動物毛發(fā)、表皮中分離提?。ɑ瘜W提?。撎崛》椒ê啽阋仔?，成本低，但純度不高；二是從酵母菌體中分離制?。ㄉ锾崛。摲椒ㄌ崛〕龅暮谏丶兌雀?，但提取菌種分離困難、設備復雜、投資巨大。本試驗將采用黑色食品表皮提取法對黑豆皮中所含黑色素進行提取。

黑色素屬于水溶性色素，易溶于水、醇、鹽酸等溶液，不溶于乙醚等有機溶劑［2］，故本試驗黑色素的提取宜用水或醇類提取劑提取。經(jīng)試驗表明，黑色素在水和稀酸溶液中的溶解度低于在醇中的溶解度，又因甲醇對身體不利，而乙醇無毒無害，且成本又低，因此試驗采用乙醇溶液作為提取劑。

黑豆皮黑色素的穩(wěn)定性研究表明，其色素耐熱能力較強，但應盡量避免高于80 ℃條件的長時間加熱；黑豆色素在酸性、避光條件下穩(wěn)定性好，呈現(xiàn)鮮艷的深玫瑰紅色。這兩項研究在本試驗中對黑色素的提取及提取液的儲存有很大提示作用，選擇黑色素提取溫度時可以80 ℃為上限，儲存時可將提取液置于冰箱中避光保 存。

很多關于黑色素抗氧化的研究都指出，黑色素能有效清除羥自由基（·OH），清除活性氧自由基以及清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）。本試驗對其清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的活性及總抗氧化能力進行研究。試驗表明，從黑豆皮提取出的黑色素具有很強的總抗氧化能力和較高的清除DPPH自由基活性。經(jīng)過相關性分析還發(fā)現(xiàn)，黑豆皮提取液的濃度與黑豆皮黑色素的總抗氧化能力具有很高的相關性，說明黑豆皮黑色素的總抗氧化能力由黑豆皮中黑色素的濃度決定。

基因表達實驗結果顯示，以黑豆皮粗提物飼喂果蠅后，SOD1、SOD2、CAT基因的表達被上調(diào)了，而長壽負調(diào)控因子MTH基因被下調(diào)了。但是這些基因被上調(diào)或下調(diào)均在飼喂15天，甚至30～50天后，至少說明這些內(nèi)源的抗氧化酶基因的調(diào)控或多或少是由于黑豆皮提取物的誘導。我們使用的是real-time PCR方法來鑒定基因的表達差異，與組成性表達的Rp49基因相比，這種方法能非常靈敏地反映微量的基因表達差異。

圖4　黑色素粗提物提取物飼喂果蠅后SOD1、SOD2、CAT和MTH基因的表達差異

長期食用含有人工合成抗氧化劑的食品，可以影響人體健康，植物來源的食品添加劑越來越受人們喜愛。植物來源的食品添加劑，特別是植物黑色素，不僅可以作為食品色素，還具有保健和治療疾病的功能，因此此類添加劑的合成越來越受研究人員的關 注。

現(xiàn)在，黑豆正越來越多地出現(xiàn)在餐桌上，隨著人們對黑色食品的青睞和黑色食品餐飲業(yè)的繁榮，作為主角的黑豆及其飲品必將占領未來的食品市場。此外，對黑豆的研究也正不斷深入，這一領域也必將取得更大的突破，黑豆無論作為功能食品還是藥品的開發(fā)，都具有非常廣闊的前 景。

之前有報道科學家利用免疫突變小白鼠來研究番茄紅素的抗衰老功能，對黑色素的抗氧化和抗衰老功能，由于受實驗條件和經(jīng)費、場地限制，我們無法使用小鼠來進行實驗，因此我們聯(lián)系了中科院生化所果蠅研究平臺，向他們咨詢了是否可以用有免疫缺陷的果蠅進行實驗，但是他們沒有，所以筆者只好使用了野生型的果蠅進行抗衰老試驗。初步的實驗結果顯示，黑豆皮黑色素提取物能促進處理后子二代果蠅幼蟲的化蛹過程，同對照組相比在同一處理時間點能增加幼蟲化蛹的數(shù)量，并且這種促進和增加作用是隨著黑色素提取物處理濃度的增加而加強。同時黑色素提取物還能增強子一代的繁殖能力以及促進子二代果蠅的生長發(fā)育。這一現(xiàn)象是否因提取物中營養(yǎng)豐富加速果蠅生長以及未來是否會因加速生長而縮短壽命抑或延長壽命還需要進一步的研究實驗。

參考文獻

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氮素水平對小麥幼苗性狀的影響

董哲宇

（同濟大學第二附屬中學，上海，200060）

摘要：小麥是一種在世界各地廣泛種植的禾本科植物，是人類的主食之一。目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中氮肥的施用量明顯超量，不僅造成經(jīng)濟損失，同時也對環(huán)境造成污染。合理施加氮肥對提升小麥產(chǎn)量與質(zhì)量有著重要的意義。不同氮素水平對小麥幼苗的性狀有著不同的影響，找出最佳氮素水平是提升肥料科學性及促進小麥幼苗實現(xiàn)最佳生長狀況的重要途徑。通過本課題研究發(fā)現(xiàn)施加氮肥可以促進小麥幼苗的生長，并且施氮量控制在0.27 g/kg時小麥幼苗的生長發(fā)育情況以及對其他營養(yǎng)元素的吸收情況較好，但對鉀的吸收有所減少，因此在這一施氮量時應適當增加鉀肥和磷肥。本課題期望為小麥種植者提供可行的參考。

關鍵詞：氮素水平　小麥幼苗　性狀　影響

小麥是一種在世界各地廣泛種植的禾本科植物，是人類的主食之一，提升小麥種植的產(chǎn)量，是小麥的種植者和栽培者的共同目標。在追求小麥高產(chǎn)的栽培過程中，合理的施用氮肥是十分重要的措施。施用氮肥對小麥的生長和產(chǎn)量具有直接的影響[1]。但是，大多數(shù)小麥的種植者并沒有掌握科學施用氮肥的方法，超量的情況比較多見[2]，這不僅導致了小麥多種病害的發(fā)生，同時，也造成了一定的經(jīng)濟損失，減低了氮肥的施用效果，污染了地下水[3]。因此，科學合理地施用氮肥是當前小麥種植中的一個不可忽視的問題，也是為社會提供安全糧食，保護生態(tài)環(huán)境的重大措施之一[4]?；诖耍菊n題探究了氮素水平對小麥幼苗性狀的影響。通過總結氮素水平對小麥幼苗性狀的影響，正確指導小麥種植者科學合理地施用氮肥，努力減輕氮肥的不合理施用對小麥質(zhì)量、生態(tài)環(huán)境等造成的不良影響。

1　材料與方法

1.1　試驗時間

2013年4～8月。

1.2　實驗材料

小麥品種為蘇麥6號。

1.3　試驗方法

本試驗設計5個施氮量等級，每個等級的施氮量從低到高分別是0、0.13、0.20、0.27、0.33 g/ kg，其中0 g/kg組為對照組。采用盆栽法栽培小麥幼苗，所用土壤從上海某實驗中心試驗田選取，其中有機質(zhì)含量約為10.74 g/kg，全氮為0.84 g/kg，速效磷（P2O5）為34.29mg/kg，速效鉀（K2O）為89.83mg/kg，所有土壤均經(jīng)風干、壓碎、過篩搬運后使用，所用盆的直徑為30 cm，高為26 cm，底部無孔，每盆栽10株。將所有盆栽置于光照培養(yǎng)箱中，澆水量和澆水次數(shù)相 同。

栽植后第7天、第14天和第21天從每盆中選取2株幼苗測量其株高、莖基寬、莖葉鮮重和干重以及葉綠素含量。葉綠素含量的測定采用葉綠素汁測定；將樣品烘干并進行濃硫酸—過氧化氫消化處理后采用凱氏法測N，釩鉬黃比色法測P，火焰分光光度法測K。

2　 結果分析

2.1　氮素水平對小麥幼苗株高和莖基寬的影響

表1　不同氮素水平對小麥幼苗性狀的影響

通過觀察發(fā)現(xiàn)（如圖1和表1所示），隨著小麥的生長，株高不斷增大，隨著施氮量的增加，小麥幼苗株高的變化呈先增高后降低的趨勢，說明不同氮素水平對小麥幼苗的株高有著顯著的影響，通過收集分析實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，0.27 g/kg處小麥幼苗株高最高；莖基寬方面的變化與株高的變化相似，即隨著施氮量的增加先變大后減小，通過數(shù)據(jù)分析可見氮素水平對小麥幼苗莖基寬有顯著影響，且0.27 g/kg組小麥莖基寬最大。

圖1　不同施氮量對小麥幼苗株高和莖基寬的影響

2.2　氮素水平對小麥幼苗分蘗數(shù)的影響

隨著小麥幼苗的生長，分蘗不斷增多。通過觀察對照組和實驗組發(fā)現(xiàn)，隨著氮素水平的增加（如圖2和表1所示），小麥分蘗數(shù)隨之增加，通過分析實驗數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)0.33 g/kg組小麥分蘗數(shù)最多，相當于對照組的2倍左右，且通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)小麥的分蘗數(shù)與施氮量呈正線性相關。

圖2　不同施氮量對小麥幼苗分蘗的影響

2.3　氮素水平對小麥幼苗莖葉鮮重、干重的影響

通過測量小麥幼苗莖葉鮮重和干重發(fā)現(xiàn)（如圖3和表1所示），前4組小麥莖葉鮮重與干重依次增大，經(jīng)數(shù)據(jù)分析各組之間的差距均達到了顯著水平，而0.33 g/kg施氮量與0.27 g/kg施氮量的小麥莖葉鮮重與干重相比無明顯增加?？梢?，小麥幼苗莖葉的鮮重和干重在氮素水平低于0.27 g/kg的情況下隨著氮素水平的提高而增大。

圖3　不同施氮量對小麥莖葉鮮重和干重的影響

圖4　不同施氮量對小麥葉綠素含量的影響

2.4　氮素水平對小麥幼苗葉片葉綠素的影響

通過實驗發(fā)現(xiàn)施氮量的增加使葉綠素的含量隨之增加（如圖4和表1所示），通過數(shù)據(jù)分析可看出葉綠素含量與施氮量間呈正相關關系，可見施加氮肥有助于增加小麥幼苗葉片中葉綠素的含量。

2.5　氮素水平對小麥幼苗氮、磷、鉀含量的影響

通過對各組小麥幼苗氮、磷、鉀含量的測定發(fā)現(xiàn)（如圖5和表1所示），小麥莖葉中的氮含量隨施氮量的增加而增大；小麥莖葉中的磷含量隨著施氮量的增加而呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，其中0.2 g/kg組和0.27 g/kg組的磷含量最大；鉀含量的變化與磷含量的變化規(guī)律相似，各組小麥莖葉中0.13 g/kg組的鉀含量最高，其他施氮量組小麥莖葉的鉀含量依次降低。以上結果說明，施加氮肥有助于小麥幼苗對磷和鉀的吸收，但過量施加則會抑制小麥幼苗吸收磷和鉀元素。

圖5　不同施氮量對小麥幼苗氮磷鉀的影響

3　總結

通過本次試驗發(fā)現(xiàn)，施加氮肥可以顯著促進小麥幼苗的生長發(fā)育，表現(xiàn)在株高的增加，莖基寬的增大，鮮重與干重的增加以及分蘗數(shù)的增加等方面，以上指標均是確保小麥產(chǎn)量與質(zhì)量的重要基礎。此外，通過實驗我們可以看出，適量的氮肥能夠有效優(yōu)化小麥幼苗的性狀，但過量的氮肥也會抑制小麥的生長發(fā)育，最終造成小麥減產(chǎn)。在本次試驗條件下，可發(fā)現(xiàn)施氮量控制在0.27 g/kg時小麥幼苗的生長發(fā)育情況及對營養(yǎng)元素的吸收情況較好，但對鉀的吸收有所減少，因此若將施氮量控制在這一水平時，應適量施加鉀肥和磷肥，以促進植株鮮重與干重的進一步增加。

參考文獻

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木槿提取物對小白鼠的毛發(fā)生長作用的研究

葛逸飛，馮文卿，吳仁杰

（同濟大學第二附屬中學，上海，200060）

摘要：將采自長風公園內(nèi)的木槿葉曬干、研磨成粉末，以石油醚為溶劑提取木槿中的有效成分，利用小白鼠為模式生物研究木槿石油醚提取物對毛發(fā)生長的影響。不同濃度的提取物處理剃毛的小白鼠皮膚，在第10、15、20天時分別拔取剃毛區(qū)域的毛發(fā)，并測量毛發(fā)的生長長度，剝離處理皮膚進行固定切片觀察毛囊發(fā)育情況。從處理結果可以看出，同對照和章光101生發(fā)劑及商品化的木槿水提取物相比，木槿葉的石油醚提取物能有效地促進小白鼠毛發(fā)的生長，促進了小鼠皮膚組織中毛囊的生長發(fā)育。

關鍵詞：木槿提取物　毛發(fā)生長　毛囊　促生長

隨著人們生活水平的提高，來自各方面的需求和壓力也與日倍增。又值秋季，到了一年中掉頭發(fā)最多的時候，然而經(jīng)常聽人抱怨一年四季都在掉頭發(fā)，而且掉很多。掉頭發(fā)在一定的量是正常的，但是超過一定的量就是一種亞健康的表現(xiàn)，而原因可能來自外界的因素，如過度的燙染、生病或內(nèi)分泌紊亂而產(chǎn)生掉發(fā)，也可能來自心理?？傊?，現(xiàn)在的趨勢是越來越多的人處在掉發(fā)困擾中。

有問題就會有機會，現(xiàn)在市面上也不乏一些洗護產(chǎn)品稱有抑制脫發(fā)和生發(fā)的效果，然而，洗發(fā)水等護理產(chǎn)品化學添加劑非常多，有十二烷基硫酸鹽等表面活性劑用來洗凈頭發(fā)，硅油等讓頭發(fā)順滑，有機酸來調(diào)節(jié)pH值，還有各種防腐劑來延長保質(zhì)期。在洗凈頭發(fā)的同時，很可能會給頭發(fā)帶來“二次污染”。目前各種植物源的洗發(fā)、護發(fā)及生發(fā)產(chǎn)品的開發(fā)與研究也越來越多。中藥應用于脫發(fā)性疾病的治療也有悠久的歷史，但機制尚不明確。相傳古人常用皂角、豬苓、淘米水來洗頭，民間也常用木槿葉來潤發(fā)，效果都非常好。那么木槿葉這種天然的洗發(fā)護發(fā)產(chǎn)品能不能加快頭發(fā)生長的作用呢？

木槿別名朝開暮落花、籬障花、雞肉花、白飯花。屬錦葵科木槿屬的落葉灌木或小喬木，株高3～6米，花色有淺藍紫色、粉紅色或白色之別，花期6～10月。木槿花含肥皂草甙，系一種黃酮甙，并含異牡荊素。此外，尚含有皂甙及黏液質(zhì)。木槿花清熱涼血，解毒消腫。治痢疾、痔瘡出血、白帶、瘡癤癰腫、燙傷。木槿葉有一定的去污能力，已有人制成木槿葉添加稻草灰的洗發(fā)水。本課題就木槿葉石油醚提取物對小白鼠毛發(fā)生長和對小鼠皮膚毛囊生長發(fā)育產(chǎn)生影響進行研究，努力為天然生發(fā)劑的研制提供基礎。

1　材料與方法

1.1　實驗儀器與設備

索氏抽提器購自上海禾汽玻璃儀器有限公司；奧林巴斯數(shù)碼生物顯微鏡，購自上海外海生物科技有限公司；超凈工作臺；生化培養(yǎng)箱；解剖顯微鏡；研缽、水浴鍋、動物剃毛器、培養(yǎng)皿、微量移液器、鑷子、記號筆等。

1.2　實驗試劑、設備與試驗動物

石油醚、液體石蠟、乙醇、二甲苯、蘇木槿—伊紅染色液。章光101生發(fā)產(chǎn)品：毛囊滋養(yǎng)液（浙江章光101有限公司）。木槿葉水提物購自淘寶網(wǎng)。索氏抽提器，水浴鍋。

實驗動物：小白鼠（上海斯萊克實驗動物有限責任公司）。

木槿葉采自長風公園內(nèi)種植的植株。將新鮮采集木槿的葉在烘箱內(nèi)烘干（溫度為65 ℃左右），研磨成均勻粉末，裝在密封容器中，存放在室溫下。

1.3　木槿葉提取

提取時，將干燥的木槿葉粉末用索氏抽提器進行抽提，提取溶劑使用石油醚，提取溫度控制在60 ℃～80 ℃。在減壓蒸餾濃縮使溶劑減少后，對提取物稱重。將木槿葉的產(chǎn)量控制在3%～5%（質(zhì)量比）。然后取1 g提取物溶入100mL液體石蠟中，制成含1%活性化合物，為體外研究毛發(fā)生長做準備。

1.4　殘留石油醚的檢測

用多氣體檢測儀（MX6 iBridTM）對提取物殘留的石油醚進行檢 測。

1.5　小白鼠毛發(fā)生長活性體內(nèi)檢測

取20～22g的雄性小白鼠38只，正常喂飼料和水。隨機分成A、B、C、D、E、F、G七組，A、B、C、D、E組各6只，F(xiàn)和G組各4只。在每只小白鼠背上用剃刀剔去一塊4 cm2的毛發(fā)，并用75%乙醇擦拭。在A、B、C、D、E、F、G組，每天為小白鼠剔去毛發(fā)的地方涂上之前準備的液體石蠟，A組涂上含1%葉提取物的液體石蠟；B組涂上含2%葉提取物的液體石蠟；C組涂上含5%葉提取物的液體石蠟；D組涂上木槿水提物；E組涂章光101毛囊滋養(yǎng)生發(fā)劑原液；F組涂上純石蠟；G組不處理，持續(xù)20天，并每天觀察。

1.6　小白鼠毛發(fā)生長活體觀察

在剃毛第10、15、20天時，每個處理選取幾只老鼠，隨機拔下剃毛區(qū)的毛發(fā)，取16根測量長度、計算平均值，并用平均值±標準差形式表示。

1.7　小白鼠毛發(fā)生長定量分析

取處理20天各組小白鼠一只脫頸椎處死，從其背部取一塊皮膚，置于4%多聚甲醛溶液中，常溫固定，不同濃度酒精脫水后，組織進行石蠟包埋，用切片機對皮膚組織進行橫切片。切片進行蘇木槿—伊紅染色，數(shù)碼顯微鏡下觀察、拍照。

1.8　統(tǒng)計學處理

采用Excel2007軟件進行統(tǒng)計學處理，對資料進行描述，用方差分析對組間資料進行分析。

2　結果與分析

2.1　木槿葉提取物制備

我們從長風公園內(nèi)采集的木槿葉在水中洗去葉片表面的灰塵等雜質(zhì)后，放入烘箱65 ℃快速烘干后用食品研磨機打磨成粉末狀。如果不能及時提取則密封儲存于室溫。

圖1　木槿葉粉末用濾紙包裹后裝入索氏抽提器

提取時稱取木槿葉粉末裝入疊成袋狀的濾紙中，置于索氏抽提器中進行抽提（如圖1所示）。

2.2　石油醚殘留的檢測

由于石油醚（petroleum ether）在藥物的研發(fā)中是一種常用溶劑，還沒有足夠的資料證明具有強的毒性。通過使用多氣體檢測儀對60 ℃水浴加熱的石油醚提取物的揮發(fā)性有機物進行檢測，其PID指數(shù)為0 ppm（如圖2所示），說明未檢測到揮發(fā)性有機物。

圖2　多氣體檢測儀對提取物殘留進行檢測

2.3　小白鼠毛發(fā)生長檢測

剃毛區(qū)的毛發(fā)在處理10天后就可以觀察到明顯的生長，并且在我們20天的觀察過程中都在不停地生長。對處理后10天、15天、20天分別從每組隨機拔取不同小鼠背部處理區(qū)域16根毛發(fā)，然后在數(shù)碼顯微鏡下利用軟件測量毛發(fā)的長度（如表1所示），并拍照記錄數(shù)據(jù)。從毛發(fā)生長檢測結果（如圖3所示）可以看出，在處理20天后，各處理組小白鼠毛發(fā)均有不同程度的生長。與對照組相比，其余六組處理都具有不同程度的生發(fā)作用（其中，我組組員認為：純石蠟組最初毛發(fā)生長高于空白組的原因是：涂抹按摩促進血液循環(huán)，同樣有利于毛發(fā)生長，到20天時，石蠟處理的毛發(fā)生長幾乎同空白處理相同）。生發(fā)的最終效果為：5%木槿石油醚提取物＞2%木槿石油醚提取物＞章光101＞木槿水提取物＞1%木槿石油醚提取物＞液體石蠟。

表1　不同處理后的毛發(fā)長度

從表1的毛發(fā)長度結果可以看出，在處理10天后，5%的木槿葉提取物處理后毛發(fā)生長最為明顯，為6350 μm，甚至高于章光101約54%，促進效果非常明顯，這種促進作用一直持續(xù)到處理后的20天。木槿葉水提物也有一定的毛發(fā)促生長效果，并且處理效果同木槿葉1%石油醚提取 物。

圖3　不同處理后的毛發(fā)長度

此外，同對照組相比，其他處理組在20天后毛發(fā)幾乎覆蓋了整個剃毛區(qū)（如圖4B和C所示），而空白對照小白鼠的剃毛區(qū)毛發(fā)較稀疏（如圖4A所示）。而從我們的木槿葉石油醚提取物處理結果可以看出，促進毛發(fā)生長的效果隨著濃度的升高而增強。

2.4　小鼠毛發(fā)生長的定性研究

小鼠剃毛后毛發(fā)生長開始的時間和完全覆蓋剃毛區(qū)的時間隨著處理的不同而表現(xiàn)為極大的不同。5%木槿葉提取物在第5天時就可以明顯看見毛發(fā)生長，并隨著處理濃度的降低毛發(fā)生長起始時間也在推遲（如表2所示）。

2.5　小鼠毛發(fā)生長的定量研究

圖4　處理20天后小白鼠剃毛去毛發(fā)生長圖

A：為空白處理小白鼠；B：為章光101處理小白鼠；C：為5%木槿葉石油醚提取物處理

表2　毛發(fā)生長的情況記錄

圖5　處理20天后皮膚切片圖

A：為空白處理；B：為章光101處理；C：為5%木槿葉石油醚提取物處理

從小鼠處理后20天皮膚切片可以看出（如圖5所示），與對照相比，章光101處理和木槿提取物的處理都增加了小鼠皮膚中毛囊的數(shù)量以及增大了毛囊的密度，而5%木槿葉石油醚提取液的處理表現(xiàn)出更高的毛囊數(shù)量和密度，更進一步驗證了前面毛發(fā)長度的結 果。

3　討論

現(xiàn)在市面上比較流行的生發(fā)產(chǎn)品主要有兩類，外用的米諾地爾類藥物以及美國FDA認證的口服非那雄胺類激素化合物。而外用的米諾地爾類藥物需要添加大量的其他化合物（如一種鉀離子通道開放劑等）才能發(fā)揮高效生發(fā)作用（Spindler，1988），因此會導致很多不利的皮膚問題，如瘙癢、干燥、產(chǎn)生皮屑、局部紅腫和皰疹等（Spindler，1988）。接受了非那雄胺治療一年的患者僅有48%的被觀察到頭發(fā)再生，服用非那雄胺的患者通常耐受性良好，但也有一些因服用該藥導致性激素異常而停止治療，此外非那雄胺并不表示用于女性患者（McClellan等，1999）。

我們使用不同濃度木槿葉石油醚提取物及生發(fā)產(chǎn)品章光101對小白鼠剃毛區(qū)進行涂抹處理20天，第10天包括空白處理，我們都可以觀察到所有的處理的小白鼠剃毛區(qū)均有不同程度的毛發(fā)生長。同空白處理相比，其他處理包括液體石蠟處理，小白鼠剃毛區(qū)的毛發(fā)均已完全覆蓋整個剃毛區(qū)。我們推測這可能由于處理時對皮膚的按摩作用促進了局部皮膚區(qū)域的血液循環(huán)，從而促進毛發(fā)的生長。到20天時，石蠟處理后的毛發(fā)生長同空白處理幾乎相同，而其他處理明顯比石蠟處理的毛發(fā)生長更有促進作用。

我們的實驗結果只能說明木槿葉石油醚提取物能促進毛發(fā)的生長，而很多研究毛發(fā)促生長藥物都是需要進行毛囊體內(nèi)實驗的。Inaoka等（1994）研究了80多種草本植物甲醇提取物的生發(fā)作用，他們報道了其中18種對小鼠毛發(fā)有明顯的促生長作用。另外有報道稱用羽芒菊乙醇提取物的石油餾分對小白鼠口服和體外涂抹處理后有明顯的毛發(fā)促生長作用（Saraf等，1991）。另外有研究表明銀杏葉70%的乙醇提取物能有效促進毛發(fā)生長并且可以用作加工洗發(fā)水（Kabyashi等，1993）。但是，還沒有任何研究報道這些提取物促進毛發(fā)生長的作用機理。因此，我們只能得出木槿葉的石油醚提取物能促進毛發(fā)的生長，并且可以用來添加制作洗發(fā)、護發(fā)的產(chǎn) 品。

此外，我們發(fā)現(xiàn)木槿葉石油醚提取物和章光101處理的皮膚毛發(fā)長勢明顯濃密，而其他處理的毛發(fā)較稀疏?？赡苡捎谀鹃热~石油醚提取物促進了皮膚的毛囊生長，增加了每個毛囊中毛發(fā)生長的數(shù)量。說明我們制備的木槿葉提取物的作用同章光101毛囊滋養(yǎng)液的作用類似。

一方面，我們曾嘗試體外毛囊培養(yǎng)處理試驗，但是始終不成功，原因可能是培養(yǎng)基選擇不當，有研究表明Williams’E無血清培養(yǎng)基效果更好；另一方面，實驗室培養(yǎng)條件不適宜毛囊生長。一般動物細胞需要二氧化碳培養(yǎng)箱。最后還有可能是我們毛囊剝離技術不夠成熟。在課題研究過程中，我們也多次想要解決這個問題，查閱了大量文獻及參考資料，并咨詢相關專家，專家建議做皮膚切片實驗來觀察毛囊的發(fā)育。從我們處理后的切片可以發(fā)現(xiàn)，同對照組相比，木槿5%提取液處理后毛囊的數(shù)量明顯增多，毛囊生長的密度明顯增大。章光101作為一種市面上暢銷的生發(fā)產(chǎn)品，其生發(fā)效果毋庸置疑，但從我們的實驗結果可以看出，其生發(fā)效果僅僅相當于木槿2%提取液，這可能由于木槿提取液中含有雌激素類成分（張辛華等，2008），雌激素可以延長毛發(fā)生長期因而促進毛發(fā)的生長。木槿提取物還可能會影響雄性激素的代謝（Sukirti等，2012）。雄性激素分泌過多是造成脫發(fā)的主要原因，雄性激素能降低女性體內(nèi)的睪丸酮含量（Sukirti等，2012），因此木槿提取物有可能是通過調(diào)節(jié)激素的方式促進毛發(fā)生長。本研究發(fā)現(xiàn)木槿提取物能明顯促進小鼠毛發(fā)生長，并能增加毛囊的數(shù)量和密度，但是仍然需要進一步研究，如用皮膚細胞的免疫組織化學研究等來闡釋毛發(fā)促生長的機制。

4　結論

在我們的實驗濃度內(nèi)可以得出以下結論：

4.1　木槿油脂提取物對毛發(fā)生長有促進作用；

4.2　木槿油脂提取物的濃度越高，對毛發(fā)生長促進作用越好；

4.3　5%木槿油脂提取物的效果比章光101好。

相比較現(xiàn)有的商品化的生發(fā)液有很多化學物質(zhì)和激素類物質(zhì)等會導致一些副作用，木槿提取物具有強大的開發(fā)前景，首先木槿提取物是純天然草本提煉的精華而受到大眾喜愛，其次不會產(chǎn)生副作用，使用安全，而且效果明顯。

5　致謝

非常感謝華師大基地的高良才老師在實驗方法和皮膚組織切片實驗中給予的指導和幫助。

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