腐植酸對(duì)草甘膦抑菌性的體外中和作用

Awad A.Shehata1,2,3　Manfred Kühnert4　Svent Haufe4　Monika Krüger1　著

朱福軍5,6　吳欽泉5,6　陳士更5，6　吳鳳林5,6　丁方軍5,6,7*　譯

(1　德國(guó)萊比錫大學(xué)獸醫(yī)系細(xì)菌和真菌研究所　萊比錫　04103

2　德國(guó)萊比錫大學(xué)Albrecht Daniel Thaer農(nóng)學(xué)院　萊比錫　04159

3　埃及薩達(dá)特城市大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院禽和兔疾病系　薩達(dá)特　999060

4　德國(guó)魏恩伯拉WHPharmawerk股份有限公司　魏恩伯拉　01689

5　山東農(nóng)大肥業(yè)科技有限公司　泰安　271000

6　山東省腐植酸高效利用工程技術(shù)研究中心　泰安　271000

7　山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院　泰安　271018)

摘　要：本文研究了不同濃度腐植酸對(duì)草甘膦抑菌作用的中和能力，測(cè)定了不同濃度腐植酸(0.25,0.5和1.0　mg/mL)在與不在下的草甘膦對(duì)不同細(xì)菌，例如栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)、青春型雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、大腸桿菌(Escherichia coli)和尼氏大腸桿菌(E.coli 1917 strain Nissle)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的最低抑菌濃度。研究結(jié)果表明，腐植酸顯著緩解了草甘膦對(duì)不同細(xì)菌的抑菌作用，可有效緩解飼料和水體中草甘膦殘留物的負(fù)面影響。

關(guān)鍵詞：草甘膦　腐植酸　微生物區(qū)　抗菌劑

Neutralization of the Antimicrobial Effect of Glyphosate by Humic Acid in Vitro

Awad A.Shehata1,2,3,Manfred Kühnert4,Svent Haufe4,Monika Krüger1　write

Zhu fujun5,6,Wu qinquan5,6,Chen shigeng5,6,Wu fenglin5,6,Ding fangjun5,6,7*　translate

(1 Institute of Bacteriology and Mycology,Faculty of Veterinary Medicine,Leipzig University,Leipzig,04103

2 Albrecht Daniel Thaer-Institute of Agronomy at the University Leipzig,Leipzig,04159

3 Avian and Rabbit Diseases Department,Faculty of Veterinary Medicine,Sadat City University,Sadat,999060

4WHPharmawerkWeinb?hla GmbH,Weinb?hla,01689

5 Shandong Agricultural University Fertilizer Science &Technology Co.,Ltd.,Tai’an,271000

6 Engineering &Technology Research Center of High Efficient Utilization of Humic Acid of Shandong Province,

Tai’an,271000

7 College of Resources and Environment,Shandong Agricultural University,Tai’an,271018)

Abstract: In the present study,the neutralization ability of the antimicrobial effect of glyphosate by different humic acids was investigated.The minimal inhibitory concentrations of glyphosate for different bacteria such as Bacillus badius,Bifidobacterium adolescentis,Escherichia coli,E.coli 1917 strain Nissle,Enterococcus faecalis,Enterococcus faecium,Salmonella enteritidis and Salmonella typhimurium were determined in the presence or absence of different concentrations of humic acid (0.25,0.5 and 1.0　mg/mL).Our findings indicated that humic acids inhibited the antimicrobial effect of glyphosate on different bacteria.This information can help overcome the negative impact of glyphosate residues infeed and water.

[收稿日期]2015-09-30

[譯者簡(jiǎn)介]朱福軍，男，1990年生，助理工程師。主要研究方向：肥料應(yīng)用技術(shù)研究。*通訊作者：丁方軍，男，教授。E-mail：sdndfyjs@163.com。

Key words: glyphosate;humic acids;microbiota;antimicrobial

草甘膦[N-(膦酸甲基)甘氨酸]是一種高效除草劑，可有效抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvyl shikimate 3-phosphate synthase，EPSPS)和控制高等植物、藻類、細(xì)菌及真菌中芳香族氨基化合物的合成酶。草甘膦的除草功能是通過螯合錳來減少EPSPS的輔助因子黃素單核苷酸(FMN)。草甘膦與其代謝物氨基甲基膦酸酯(amino methyl phosphonate，AMPA)已在綠色未成熟的種子，收獲的種子和地下水中被發(fā)現(xiàn)。草甘膦殘留物根據(jù)國(guó)家的不同而不同(在某些國(guó)家草甘膦已失控)，甚至在一個(gè)國(guó)家里草甘膦的應(yīng)用數(shù)量和頻率都不加控制。作物干燥收獲前施用草甘膦亦會(huì)導(dǎo)致食物來源中其殘留量的升高。草磷酸每日最大允許攝入量(maximum daily intake，MDI)取決于口糧成分和口糧中每一被污染組分的百分比。此外，草甘膦在轉(zhuǎn)基因大豆種植區(qū)水樣中也被發(fā)現(xiàn)，其濃度在0.10～0.70mg/L之間。在德國(guó)的一些家禽和飼料樣品中，草甘膦也被檢出，其含量為0.4～0.9mg/kg(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。學(xué)者們對(duì)草甘膦除草劑的安全性是存在爭(zhēng)議的。一些報(bào)告認(rèn)為，由于EPSPS在動(dòng)物中并不存在，草甘膦的使用不會(huì)對(duì)人和動(dòng)物的健康產(chǎn)生顯著危害。然而，有研究指出，草甘膦仍可通過其他途徑危害人和動(dòng)物的健康，例如對(duì)細(xì)胞色素P450芳香化酶的抑制。

相關(guān)研究已證實(shí)，脊椎動(dòng)物中的草甘膦是具有遺傳毒性的，可致畸、對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害和最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。草甘膦可在非常低的，低于農(nóng)業(yè)稀釋水平下對(duì)人類胎盤、胚腎、肝細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)胞毒害。草甘膦誘導(dǎo)體外成熟大鼠睪丸細(xì)胞的壞死和凋亡，并顯著降低睪丸酮素到低濃度(1 ppm)。最近有學(xué)者提出，草甘膦可能是德國(guó)過去10～15年來牛肉毒梭狀芽胞桿菌感染危險(xiǎn)增加的重要因素。草甘膦對(duì)腸球菌屬(Enterococcus spp.)的毒性可引起腸粘膜上的菌群失衡，導(dǎo)致梭菌屬(Clostridium spp.)的過度生長(zhǎng)，這是因?yàn)檎Ｓ幸婢c球菌屬可抑制梭菌屬的生長(zhǎng)繁殖。

腐植酸被歸類為多價(jià)的弱有機(jī)酸，具有化學(xué)形成復(fù)合物的能力。目前，利用腐植酸及其鈉鹽對(duì)農(nóng)場(chǎng)中動(dòng)物進(jìn)行口腔治療已得到許可。雖然諸多研究表明，草甘膦可被腐植酸吸收，然而有關(guān)腐植酸對(duì)草甘膦抑菌性影響的研究未見報(bào)道。因此，本研究將對(duì)腐植酸對(duì)草甘膦抑菌性的體外中和能力進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1　指示微生物

本研究利用以下細(xì)菌作為指示微生物：栗褐芽孢桿菌(Bacillus badius)、青春型雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、尼氏大腸桿菌(E.coli 1917 strain Nissle)、糞腸球菌(Enterococcus faecalis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)。培養(yǎng)條件和菌株來源參見表1。

1.2　最低抑菌濃度

根據(jù)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定草甘膦對(duì)這些病原菌的最低抑菌濃度(MIC)。在24孔微孔板中對(duì)草甘膦產(chǎn)生殺菌或抑制細(xì)菌繁殖效果的最低濃度進(jìn)行測(cè)定。在肉湯培養(yǎng)基中對(duì)草甘膦進(jìn)行系列稀釋(10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，0.075mg/mL)，之后向微孔板內(nèi)接種細(xì)菌(105　CFU/mL)，然后37℃恒溫培養(yǎng)。草甘膦對(duì)細(xì)菌的最低抑菌濃度通過細(xì)菌在瓊脂培養(yǎng)基生長(zhǎng)的定量分析來最終計(jì)算(表1)。

1.3　利用腐植酸中和草甘膦對(duì)細(xì)菌的抑制活性

在1mg/mL各腐植酸(WH67/1，WH67/2，WH67/3，WH67/4，WH67/5，WH67/6.1，WH67/6.2，WH67/7，WH67/8.1，WH67/8.2及WH67/9)(德國(guó)魏恩伯拉WHPharmawerk股份有限公司)存在下，測(cè)定草甘膦(10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，0.075mg/mL)對(duì)糞腸球菌、栗褐芽孢桿菌、青春型雙歧桿菌的最小抑菌濃度。在不同草甘膦濃度(10，5，2.5，1.2，0.6，0.3，0.15，0.075mg/mL)存在下，對(duì)栗褐芽孢桿菌、青春型雙歧桿菌、大腸桿菌、尼氏大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)影響最有效的是1mg的腐植酸WH67/4，草甘膦濃度為0.5和0.25mg/mL。

表1　草磷酸試驗(yàn)中使用的目標(biāo)菌株、菌株來源和培養(yǎng)基質(zhì)
Tab.1 Target strains used,their origin and medium used for glyphosate experiments

注：a　血瓊脂(德國(guó)Fluka公司)；
　b　RCM：增強(qiáng)型梭菌屬培養(yǎng)基(德國(guó)SIFIN公司)；
　c　MRS：乳酸菌瓊脂(德國(guó)Oxoid公司)；
　d　CATC：檸檬酸-吐溫-碳酸鹽瓊脂(德國(guó)Oxoid公司)；
　e　Caso瓊脂(3.5%大豆酪蛋白，0.3%酵母提取物，0.1%葡萄糖，1.5%瓊脂)。

2　結(jié)果與討論

草甘膦對(duì)糞腸球菌、青春型雙歧桿菌和栗褐芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為0.3mg/mL，0.3mg/mL和0.15mg/mL。腐植酸可以通過不同方式中和草甘膦的抑菌性。其中，濃度為1mg/mL的腐植酸WH67/2、WH67/3和WH67/4對(duì)草甘膦抑菌性的中和作用最強(qiáng)。在腐植酸WH67/2、WH67/3和WH67/4(1mg/mL)存在下，草甘膦對(duì)糞腸球菌、青春型雙歧桿菌和栗褐芽孢桿菌的最低抑菌濃度菌大于2.4　mg/mL。其他腐植酸的中和活性相對(duì)較低，在這些腐植酸存在下，草甘膦對(duì)以上3種細(xì)菌的最低抑菌濃度介于0.3～0.6mg/mL之間。以上結(jié)果表明，腐植酸物質(zhì)對(duì)草甘膦的吸附能力會(huì)因其大分子結(jié)構(gòu)的不同而存在較大差異，此結(jié)果與先前的研究結(jié)果一致，即腐植酸可吸附草甘膦且可形成相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物。

腐植酸WH67/4中和草甘膦對(duì)栗褐芽孢桿菌、青春型雙歧桿菌、大腸桿菌、尼氏大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌的抑制作用，呈現(xiàn)出劑量依賴性(圖1)。甚至在低濃度(0.25mg/mL)的腐植酸WH67/4下，對(duì)草甘膦敏感的腸球菌、雙歧桿菌和栗褐芽孢桿菌依然可在含0.6 mg草甘膦培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好(圖1)。與之相反，在1mg/mL濃度時(shí)，腐植酸WH67/4未能中和草甘膦對(duì)沙門氏菌的抑制作用。此外，腐植酸對(duì)高濃度草甘膦并無中和作用，原因是高濃度草甘膦并不具有生物相關(guān)性，其量已超過了飼料和環(huán)境中草甘膦預(yù)期含量的許多倍。值得一提的是，當(dāng)草甘膦濃度較農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中檢出的低時(shí)，其對(duì)微生物生長(zhǎng)有抑制作用和抗生素效果。由于微生物群間的敏感性差異，草甘膦可對(duì)細(xì)菌群落產(chǎn)生干擾。導(dǎo)致生物體產(chǎn)生響應(yīng)的任何環(huán)境改變可被視為是一種脅迫。在生物學(xué)中觀測(cè)到的生物脅迫被認(rèn)為是一種全球現(xiàn)象，這種現(xiàn)象可擴(kuò)展到人為壓力，例如基因工程或異型生物質(zhì)(包括草甘膦)污染。通過腐植酸使腸球菌和雙歧桿菌免受草甘膦殘留物的危害可降低草甘膦誘導(dǎo)的菌落失調(diào)和降低感染肉毒菌的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)橐延醒芯孔C實(shí)腸球菌對(duì)梭狀芽孢桿菌具有拮抗作用。雙歧桿菌對(duì)草甘膦是敏感的，被認(rèn)為可創(chuàng)造出如沙門氏菌等致病菌的不利條件。所測(cè)試的腐植酸并未對(duì)所試細(xì)菌生長(zhǎng)產(chǎn)生直接的顯著影響(圖1)。

圖1　腐植酸WH67/4對(duì)草甘膦抑菌作用的中和
Fig.1 Neutralization of the antimicrobial effect of glyphosate to different bacteria withWH67/4 humic acid (HA)

注：每毫升細(xì)菌數(shù)為log10　CFU的平均值。

總之，在飼料中補(bǔ)充腐植酸不僅可大幅度降低霉菌中毒現(xiàn)象，還可中和草甘膦的抑菌作用，且降低動(dòng)物產(chǎn)品中的草甘膦累積。此外，在環(huán)境治理中應(yīng)用腐植酸也可顯著提高生態(tài)系統(tǒng)中的微生物多樣性。

參考文獻(xiàn)(略)

譯自：Chemosphere，2014，104:258～261。