RNA干擾（RNA interference，RNAi）是近年來出現(xiàn)的一種利用小分子雙鏈RNA（double strain RNA，dsRNA）高效、特異的阻斷體內(nèi)特定基因表達(dá)或使其沉默，誘使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因表型缺失的技術(shù)。它是轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing，PTGS）的一種，由于RNAi可以作為一種簡單、有效的代替基因敲除的遺傳工具，曾被Science評為2001年度最重要的成果之一，而被形象地譽(yù)為基因敲低（knock down）或基因沉默（gene silencing），已被廣泛用于基因功能、基因治療和新藥開發(fā)等研究領(lǐng)域。

（一）RNA干擾的機(jī)制

RNAi的確切機(jī)制尚不清楚，許多研究結(jié)果顯示dsRNA通過干擾基因組DNA的甲基化、轉(zhuǎn)錄后水平降解mRNA及蛋白質(zhì)的翻譯等不同的機(jī)制對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而誘導(dǎo)特定基因的沉默。

1．轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制　外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因、病毒感染等各種方式導(dǎo)入的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割成約22bp的具有雙鏈結(jié)構(gòu)的小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA），這些siRNA具有5′磷酸、3′羥基末端以及兩個游離核苷酸突出，這種結(jié)構(gòu)在RNAi調(diào)控途徑中起著關(guān)鍵性的作用。siRNA與核酶結(jié)合形成沉默復(fù)合物（RNA induce silencing complex，RISC）。隨即RISC中的siRNA在Dicer酶解旋酶活性作用下開始解旋、解鏈，然后依靠siRNA反義鏈，通過堿基配對定位到同源mRNA上，此過程需ATP提供能量。部分結(jié)合到mRNA的單鏈siRNA充當(dāng)引物，以mRNA為模板合成新的dsRNA，新合成的dsRNA仍可被Dicer酶切割而發(fā)揮調(diào)控作用；部分siRNA在其3′端下游12個堿基的位置由Dicer酶切割mRNA，切割后的mRNA由于沒有5′帽狀結(jié)構(gòu)和Poly（A）尾巴的保護(hù)，很快被其他的核酸酶降解。

2．翻譯水平的調(diào)節(jié)機(jī)制　細(xì)胞內(nèi)70bp的莖環(huán)結(jié)構(gòu)或dsRNA前體轉(zhuǎn)錄物被Dicer／Argonaute復(fù)合物特異性識別后，降解成為成熟的大小為21bp、5′端為單磷酸基、3′端為羥基的單鏈小RNA分子，即小時序RNA（small temporal RNA，stRNA）或微RNA（micro RNA，miRNA）。stRNA與相關(guān)蛋白結(jié)合成另一種RISC復(fù)合體，可識別并結(jié)合靶序列的3′端非編譯區(qū)（UTR），抑制其翻譯過程從而調(diào)控基因表達(dá)。

3．基因組DNA甲基化機(jī)制　在植物研究中發(fā)現(xiàn)dsRNA可以影響基因組的甲基化修飾及改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)，從而調(diào)控基因的表達(dá)，為RNAi的機(jī)制帶來了極大的補(bǔ)充。若外源基因以多拷貝形式整合到同一位點(diǎn)上形成正向或反向重復(fù)，甲基化酶可識別這些重復(fù)序列，引起這些基因位點(diǎn)的甲基化。若甲基化發(fā)生在啟動子則產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS）；如果發(fā)生在編碼序列則產(chǎn)生PTGS。dsRNA還可通過細(xì)胞內(nèi)一種名為Polycomb的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象的“開關(guān)”狀態(tài)。在這一過程中，dsRNA或siRNA通過堿基互補(bǔ)首先與靶DNA序列結(jié)合，隨后引導(dǎo)Polycomb復(fù)合體與鄰近序列結(jié)合，靶基因隨即沉默，這一效應(yīng)可在細(xì)胞分裂后傳至下一代。

（二）RNA干擾技術(shù)

1．編碼區(qū)RNAi技術(shù)　最初是通過注射或浸泡等方法直接導(dǎo)入dsRNA。該法雖然可以達(dá)到關(guān)閉目的基因的表達(dá)和產(chǎn)生突變表型的目的，但這種表型變化卻不能遺傳，存在一定的局限性。為解決此技術(shù)上的不足，Y Tavernarakis等（2000）將目的基因的靶序列以反向重復(fù)的方式，由熱激啟動子控制在轉(zhuǎn)基因生物中表達(dá)。熱激處理后，反向重復(fù)序列在細(xì)胞內(nèi)開始轉(zhuǎn)復(fù)，其產(chǎn)物會形成具發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的dsRNA，從而產(chǎn)生RNAi，使目的基因沉默，這種改進(jìn)的RNAi能夠在發(fā)育的特定階段出現(xiàn)，且RNA干擾不僅發(fā)生在親代動物本身，還發(fā)生于子代動物中，有利于突變的分析。

2．啟動子區(qū)RNAi技術(shù)　啟動子區(qū)RNAi技術(shù)是應(yīng)用啟動子區(qū)的dsRNA使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化，使啟動子失去功能，致其下游基因沉默。因多基因家族各成員間高度同源，而其啟動子序列通常比編碼區(qū)變化大，采用啟動子區(qū)RNAi技術(shù)有利于多基因家族各成員區(qū)功能的分開研究。

（三）在醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)中的應(yīng)用

RNAi技術(shù)與其他幾種進(jìn)行功能喪失或降低的技術(shù)相比，具有以下明顯優(yōu)點(diǎn)：①RNAi具有高度特異性，對某些特定目的基因的dsRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)僅能使該基因的mRNA發(fā)生特異性降解，特異性阻抑該內(nèi)源基因的功能。②RNA干涉抑制基因的表達(dá)具有高效性，低濃度的dsRNA可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的阻抑效應(yīng)。研究表明每個細(xì)胞內(nèi)只要有幾分子的dsRNA就能作用于高豐度的內(nèi)源性mRNA分子，阻抑靶基因的功能。③干涉作用的廣泛性：在部分生物中，siRNA分子能通過細(xì)胞膜、細(xì)胞間和組織屏障被轉(zhuǎn)運(yùn)，從而使得RNA干擾作用廣泛。例如在線蟲小腸中微注射稀釋的dsRNA分子，在線蟲小腸以外的其他組織也產(chǎn)生對靶基因的阻抑效應(yīng)；如果用含表達(dá)目的基因dsRNA載體的大腸桿菌喂養(yǎng)線蟲，在體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等中都產(chǎn)生dsRNA介導(dǎo)的RNA干擾；在美麗線蟲中RNA干擾不僅發(fā)生在親代動物本身，還發(fā)生在子代動物中。④與傳統(tǒng)研究基因的方法如基因敲除、誘變等技術(shù)相比，RNAi技術(shù)具有簡單、快速、省時、省力等特點(diǎn)。

綜上，RNAi技術(shù)比反義RNA技術(shù)和同源共抑制更有效，更容易產(chǎn)生功能喪失，且通過與細(xì)胞特異性啟動子及可誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合使用，還可在發(fā)育的不同時期或不同器官中有選擇地進(jìn)行，與TDNA技術(shù)引起的功能永久性缺失相比，它更受科學(xué)家的偏愛。近年來，在醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)研究中也有報道。

德國歐洲分子生物實(shí)驗(yàn)室（European Molecular Biology Laboratory）的Christophides K．博士與其研究小組于2004年3月份在《science》上提出利用蚊本身的免疫系統(tǒng)殺滅其體內(nèi)瘧原蟲的新的抗瘧戰(zhàn)略。他們在研究中發(fā)現(xiàn)了若干蚊體內(nèi)基因，這些基因可影響蚊體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而影響瘧原蟲在蚊子體內(nèi)的生存發(fā)育。例如，當(dāng)利用RNA干擾技術(shù)剔除CTL基因（CTL4與CTLMA2）后，蚊體內(nèi)對瘧原蟲的免疫能力極大提高，可將高達(dá)97%的瘧原蟲全部殺滅。

Yuan等（2002）用RNAi技術(shù)將果蠅心臟相關(guān)基因tinman和無翅基因（wingless）的dsRNA顯微注射于果蠅的早期胚胎中，得到與這2個基因突變體完全相似的RNA表型。tinman dsRNA能導(dǎo)致內(nèi)臟的中胚層缺陷和橫紋肌斷裂，wingless dsRNA僅影響心臟前體的形成，表明RNAi能在果蠅基因功能的研究中發(fā)揮作用。

盡管在短短幾年內(nèi)對RNAi技術(shù)的研究已取得了許多重要成果，但尚存在較多理論和技術(shù)問題亟待解決。然而，隨著人們對RNAi技術(shù)的理論認(rèn)識不斷深入，技術(shù)手段日臻完善，該技術(shù)必將成為我們研究醫(yī)學(xué)昆蟲的重要研究手段。