聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是1985年由美國(guó)Kary Bank Mulis發(fā)明的一種可在體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR技術(shù)具有特異、敏感和快速3個(gè)顯著特點(diǎn)，可在數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得純度極高的目的DNA片段，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的基因研究和分析，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影響。

（一）基本原理

PCR是一種在引物介導(dǎo)和耐熱DNA聚合酶作用下體外模擬天然DNA復(fù)制過(guò)程的酶促反應(yīng)，包括高溫變性、低溫退火、適溫延伸三個(gè)階段，具有高度的特異性和敏感性。PCR采用一對(duì)寡聚核苷酸作為引物，通過(guò)加溫變性－退火－DNA合成周期性多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴(kuò)增。經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)后，擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106，理論上可檢出樣品中單一拷貝的DNA片段。

PCR問(wèn)世后，為適應(yīng)不同需求，新的PCR技術(shù)不斷涌現(xiàn)，進(jìn)一步提高了其特異性和敏感性。如反轉(zhuǎn)錄PCR（RT－PCR）是以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再做PCR擴(kuò)增，故可檢測(cè)特異的mRNA或其cDNA克隆。若僅有很少的資料，可通過(guò)錨式PCR（anchored PCR）對(duì)mRNA進(jìn)行分析。對(duì)于只知一側(cè)序列信息片段的擴(kuò)增，通?？刹捎梅聪騊CR（inverse PCR）。差異顯示PCR（differential display PCR）可以鑒定和分離在不同條件下（如機(jī)體或細(xì)胞受某種刺激或患有某種疾?。┠撤N基因的表達(dá)產(chǎn)物，無(wú)需確切的序列資料。隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析（random amplified polymorphismic DNA，RAPD）是用隨機(jī)序列引物（通常為10bp）從基因組DNA中擴(kuò)增出一組大小不等的片段，此種方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物類型具有種群和個(gè)體特異性，可用于昆蟲(chóng)進(jìn)化研究、種型鑒定和多態(tài)性分析。聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）是指應(yīng)用PCR將目的基因片段擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶消化不同個(gè)體的同源DNA分子，經(jīng)電泳分離后表現(xiàn)的限制性片段長(zhǎng)度差異。這種差異主要來(lái)源于基因突變和DNA分子結(jié)構(gòu)重排所引起的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變。PCR－RFLP主要用于昆蟲(chóng)遺傳連鎖圖的構(gòu)建、遺傳系譜分析和數(shù)量遺傳研究等方面。聚合酶鏈反應(yīng)－單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products，PCR－SSCP）是采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某一特定的DNA片段，在高溫下使雙鏈DNA變性為單鏈DNA（single strand DNA，ssDNA），然后進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，ssDNA帶在凝膠中位置的差異反映了DNA序列的差異，用于點(diǎn)突變和多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)。雙鏈構(gòu)象多態(tài)性（Double－strand conformational polymorphism，DSCP）是在SSCP的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，二者原理相同，均使用保守引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，故結(jié)果穩(wěn)定。但DSCP不需DNA分子變性，可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，是昆蟲(chóng)種群生物學(xué)研究中一種很有效的方法。

（二）基本PCR技術(shù)

與常規(guī)的DNA合成反應(yīng)一樣，PCR體系中的基本要素是：①模板DNA，可以是單鏈或雙鏈，可以是提取的基因組DNA或cDNA，也可以是克隆的質(zhì)粒DNA或環(huán)狀DNA。②一對(duì)寡聚DNA引物，分別與模板DNA鏈兩側(cè)的3′端序列互補(bǔ)，可使二者間的DNA序列得以擴(kuò)增。引物長(zhǎng)度一般以15～30個(gè)核苷酸為宜，以確保較高的PCR擴(kuò)增效率和特異性。③耐熱DNA聚合酶，通常是Taq DNA聚合酶或其類似物，可在高溫下（72℃）催化DNA合成，并能在加熱95℃時(shí)不變性。④緩沖液，提供DNA合成反應(yīng)所需pH、離子強(qiáng)度等環(huán)境。⑤4種單核苷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），提供DNA合成的原料。

合理的引物設(shè)計(jì)是PCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵，影響PCR結(jié)果的主要因素是熱循環(huán)中變性與退火溫度及緩沖液中Mg2＋離子濃度，此外提高退火步驟的嚴(yán)格性、增加聚合酶穩(wěn)定性、減少引物與模板的非特異性反應(yīng)，均可極大提高PCR的敏感性、特異性和產(chǎn)量。

（三）在醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)中的應(yīng)用

目前，有關(guān)昆蟲(chóng)分子生物學(xué)研究已有較多報(bào)道。因PCR技術(shù)能將極微量目的DNA進(jìn)行大量擴(kuò)增，可大大提高對(duì)DNA分子的分析和檢測(cè)能力，故很多種分子生物學(xué)技術(shù)均以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，其在醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)中的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。

宋社吾等（2002）通過(guò)分組織的PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)尖音庫(kù)蚊復(fù)合組和白紋伊蚊體內(nèi)感染的Wolbachia株不僅局限于生殖組織內(nèi)，在淡色庫(kù)蚊（Cx．pipiens pallens）和騷擾庫(kù)蚊（Cx．pipiens molestus）雌蚊卵巢、中腸和胸部肌肉組織中也檢測(cè)到Wolbachia株，此研究結(jié)果的可靠性也得到透射電鏡從形態(tài)學(xué)角度的證實(shí)。

李朝飛等（2003）經(jīng)RT－PCR分析發(fā)現(xiàn)，泛素基因在所檢測(cè)的斜紋夜蛾幼蟲(chóng)多種組織，尤其是脂肪體中均有表達(dá)。采用構(gòu)建的原核表達(dá)載體pQEUB，在大腸桿菌M15中高效表達(dá)，為進(jìn)一步研究S．1itura泛素在SpltMNPV感染中的作用打下了基礎(chǔ)。

RAPD－PCR主要適用于種群遺傳多樣性的研究，Kambhampti等（1992）采用RAPD技術(shù)對(duì)伊蚊的種和種群進(jìn)行鑒定和區(qū)分，并對(duì)RAPD的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、統(tǒng)計(jì)分析及應(yīng)用等進(jìn)行了探討。其后RAPD在按蚊的種群研究及舞毒蛾（Garnei，1996）、果蠅（陳燕茹，1997）和煙粉虱（邱寶利，2003）等昆蟲(chóng)中均有應(yīng)用。

嗜人錐蠅（初生）Cochliomyia hominivorax和次生錐蠅C．macellaria幼蟲(chóng)形態(tài)相似，只是發(fā)育階段不同，能引起相同的蠅蛆病，從形態(tài)學(xué)上很難進(jìn)行鑒別，Litjens P等（2001）根據(jù)其線粒體基因片段的PCR－RFLP分析，成功鑒定了這兩種幼蟲(chóng)。

Hiss等（1994）首次將PCR－SSCP用于昆蟲(chóng)研究，對(duì)5種蚊子線粒體中核糖體RNA（rRNA）進(jìn)行SSCP分析，銀染后檢測(cè)結(jié)果顯示：在所有的種群中均可觀察到種的特異性電泳類型，而且種內(nèi)單個(gè)核苷酸替代也可檢測(cè)到，表明PCR－SSCP是一種很好的遺傳分析手段。李石柱等（2003）也采用PCR－SSCP技術(shù)，對(duì)我國(guó)多斑按蚊復(fù)合體5個(gè)成員種的28S－D3擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果顯示電泳條帶具種特異性，可用于鑒別蚊種。

Atkinson等（1997）在白蟻種群研究中，采用DSCP技術(shù)對(duì)mtDNA控制區(qū)的DNA片段進(jìn)行分析，證明DSCP是一種昆蟲(chóng)種群生物學(xué)研究的有效方法，同時(shí)還用雙翅目果蠅及膜翅目螞蟻進(jìn)行了驗(yàn)證。

PCR是分子生物學(xué)技術(shù)的典型代表，隨著分子生物學(xué)新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)和現(xiàn)有技術(shù)的不斷完善，越來(lái)越多的學(xué)者將PCR應(yīng)用于昆蟲(chóng)學(xué)研究，這將極大推動(dòng)昆蟲(chóng)的遺傳背景、致病機(jī)制、生物利用等方面的實(shí)驗(yàn)研究。