組織工程軟骨檢測技術(shù)_組織工程學(xué)實驗技

各類軟骨組織因在體內(nèi)存在部位不同，功能上也有較大差異。組織工程技術(shù)再生軟骨或缺損區(qū)修復(fù)軟骨，能否真正達(dá)到正常軟骨組織的形態(tài)并具備相應(yīng)功能，必須通過全面的檢測與評價，并與相應(yīng)的正常軟骨進(jìn)行系統(tǒng)地比較才能得出較為客觀的結(jié)論?？傮w上講，對組織工程技術(shù)再生軟骨的檢測與評價指標(biāo)至少應(yīng)包括大體觀察、組織學(xué)檢查、生物力學(xué)檢測及軟骨特異性基質(zhì)含量的定量半定量檢測等幾個方面。按標(biāo)本取材后的處理順序，相關(guān)檢測的具體操作步驟如下。

一、大 體 觀 察

不同部位再生軟骨的觀察內(nèi)容與側(cè)重點略有不同。對于軟骨缺損修復(fù)結(jié)果的觀察，取材時應(yīng)將整個修復(fù)組織連同部分正常組織一并取材，以便對修復(fù)界面進(jìn)行觀察。對于關(guān)節(jié)缺損修復(fù)的觀察還應(yīng)包括軟骨下松質(zhì)骨修復(fù)的觀察?？梢杂秒婁弻⒄麄€缺損修復(fù)區(qū)連同周圍部分正常軟骨及松質(zhì)骨一起鋸下，然后從缺損中央鋸開，以便觀察缺損內(nèi)部修復(fù)情況。

1．皮下構(gòu)建軟骨大體觀察　新生軟骨表面的觀察主要從色澤、質(zhì)地、光滑程度、連續(xù)性及其與正常軟骨的相近程度幾個方面進(jìn)行比較和觀察。剖面重點觀察新生軟骨的均質(zhì)程度，有無中空現(xiàn)象，有無纖維性組織摻雜等。此外，對于皮下構(gòu)建的軟骨可以通過測定新生軟骨的體積（排水法）和濕重對新生軟骨進(jìn)行初步的定量評價。

2．關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)大體觀察　缺損修復(fù)表面主要觀察軟骨缺損修復(fù)面積，新生軟骨表面的色澤、光滑程度及其與周圍正常關(guān)節(jié)軟骨的連續(xù)性，有無明顯的凹陷或斷裂，有無明顯的軟骨下松質(zhì)骨外露等。剖面主要觀察新生軟骨、骨與正常的軟骨、骨之間是否有明顯的界面，修復(fù)軟骨厚度，修復(fù)部分有否明顯的凹陷與空洞，有無軟組織摻雜，軟骨與松質(zhì)骨交界面與正常有無差異。

3．半月板軟骨缺損修復(fù)大體觀察　缺損修復(fù)表面主要觀察軟骨缺損修復(fù)范圍，新生軟骨表面的色澤、光滑程度及其與周圍正常半月板軟骨組織的連續(xù)性，半月板大體形態(tài)是否正常，有無明顯的凹陷或斷裂，與周圍正常組織有無明顯粘連等。剖面主要觀察新生半月板軟骨與正常組織有無明顯的界面，修復(fù)有無明顯的凹陷與空洞，有無軟組織摻雜等。

二、生物力學(xué)（抗壓彈性模量）測定

主要用于評價組織工程技術(shù)構(gòu)建軟骨的力學(xué)特性，推斷其是否具備體內(nèi)正常軟骨所行使的支撐、保護(hù)、分散應(yīng)力、減小振蕩等相應(yīng)功能。大致方法如下：

將皮下構(gòu)建的軟骨或軟骨缺損（關(guān)節(jié)或半月板缺損）修復(fù)區(qū)全部新生軟骨組織修剪成直徑6mm的圓形軟骨片，轉(zhuǎn)移到相應(yīng)直徑大小的壓力測定標(biāo)本槽內(nèi)，加入少許PBS，輸入軟骨片相應(yīng)的厚度，以最大負(fù)荷450N的壓力，1mm／min的位移速度加壓，根據(jù)軟骨的厚度、力－時間－位移曲線，生物力學(xué)分析儀（INSTRON　5542型）可自動將所得彈性模量（Young’s　modulus）的平均值列出。反復(fù)測定3～5次，比較其與相應(yīng)正常軟骨組織的差異。

三、蛋白多糖（GAG）含量測定

GAG是軟骨組織相對特異性的細(xì)胞外基質(zhì)，它的含量是否正常對于維持軟骨功能非常重要。因此，測定新生軟骨中的GAG含量是檢測與評價組織工程化軟骨成熟程度及是否功能正常的一項重要指標(biāo)。測定GAG含量最常用的方法是阿利辛藍(lán)法，其大致方法及具體步驟如下：

1．配制裂解液　50mmol／L　Tris．Cl（pH＝8．0）、150mmol／L　NaCl、100mg／L苯基甲基磺酰氯（PMSF）、1mg／L抑蛋白酶肽（aprotinin）、1%吐溫－20、0．5%去氧膽酸鈉、0．1%十二烷基硫酸鈉（SDS）。

2．配制阿利辛藍(lán)儲液　5g阿利辛藍(lán)溶于100ml　0．018mol／L　H2SO40．4mol／L GnCl。

3．配制溶液1　0．054mol／L　H2SO4 0．75%Triton　X－100。

4．配制溶液2　5ml　阿利辛藍(lán)儲液中加入1．0ml　1．8mol／L　H2SO4、8．0ml　8mol／L GnCl、2．5ml　10%Triton　X－100，最后加ddH2O定溶至100ml。

5．標(biāo)本處理　取50mg待測軟骨組織，加入適量裂解液（約200μl）研磨形成糜狀，－60℃凍干，凍干產(chǎn)物以1ml　PBS溶解。

6．GAG含量測定過程

（1）50μl標(biāo)本溶液與50μl　8mol／L　GnCl混勻，靜置15min。

（2）依次加入50μl溶液1、750μl溶液2，振蕩混勻，4℃反應(yīng)1h。12　000r／min離心15min，棄上清。

（3）750μl二甲基亞砜（DMSO）洗液（40%DMSO－0．05mol／L　MgCl2）室溫下振洗30min，12　000r／min離心15min，棄上清。

（4）加入100μl溶解液（4．0mol／L GnCl－33%異丙醇）重新溶解阿利辛藍(lán)－蛋白聚糖沉淀復(fù)合物，吹打均勻。

（5）溶解后的液體轉(zhuǎn)移入96孔板中，酶標(biāo)儀600nm波長處測定吸光度值。將ddH2O和裂解液同樣處理，分別作為空白對照及陰性對照。

（6）將硫酸軟骨素（CS）梯度稀釋至1、2、10、20、30、40g／L，按上述處理標(biāo)本溶液同樣方法測定其吸光度值，繪制硫酸軟骨素（CS）濃度－吸光度值標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（7）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)本的吸光度值測算出標(biāo)本中蛋白聚糖的實際含量。

四、組織學(xué)檢查

組織學(xué)檢查是評價組織工程化軟骨與正常軟骨相似程度的最重要指標(biāo)之一，它可以較為明確地判斷組織工程化軟骨的成熟程度、均質(zhì)程度及其與周圍正常組織的界面愈合與連續(xù)性等。組織學(xué)觀察的內(nèi)容與側(cè)重點與大體觀察基本一致，只是從宏觀結(jié)構(gòu)觀察轉(zhuǎn)變?yōu)槲⒂^結(jié)構(gòu)的觀察。組織學(xué)檢查的操作過程主要包括標(biāo)本的固定、包埋（關(guān)節(jié)組織須先經(jīng)脫鈣等處理）、切片及各種染色處理，軟骨組織學(xué)檢查的基本操作過程與其他組織大致相同，這里僅介紹幾種軟骨檢測與鑒定中常用的染色方法及相應(yīng)觀察內(nèi)容。

（一）HE染色

主要觀察新生組織的一般組織學(xué)形態(tài)，包括新生軟骨的成熟度、細(xì)胞密度，有無成熟軟骨陷窩結(jié)構(gòu)（纖維軟骨無明顯陷窩結(jié)構(gòu)），有無纖維性組織摻雜，有無新生血管，對于軟骨缺損修復(fù)結(jié)果，除上述一般組織形態(tài)觀察外，應(yīng)注意觀察修復(fù)軟骨與正常軟骨交界處是否連續(xù)，修復(fù)軟骨厚度與周圍正常軟骨有無差異，缺損修復(fù)區(qū)內(nèi)有無組織斷裂。關(guān)節(jié)缺損修復(fù)還應(yīng)觀察新生軟骨與松質(zhì)骨之間有無骺板樣組織形成，缺損區(qū)骨組織內(nèi)有無纖維化，有無成熟的骨小梁與骨陷窩等。HE染色的主要操作步驟如下。

1．石蠟切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ內(nèi)脫蠟2次，5～10min／次。

2．無水乙醇Ⅰ、Ⅱ各2min，依次經(jīng)過95%、85%、75%乙醇各3min復(fù)水。

3．自來水徹底沖洗，蒸餾水洗2次。

4．蘇木精染液染細(xì)胞核5～15min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇（70%）分化數(shù)秒；流水沖洗10～30min。蒸餾水沖洗。

5．伊紅染液染色1～2min。

6．經(jīng)95%、100%乙醇依次脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

7．染色結(jié)果，細(xì)胞核呈深藍(lán)色，軟骨基質(zhì)染成藍(lán)色至深藍(lán)色，骨小梁呈紅色。彈性軟骨及透明軟骨陷窩結(jié)構(gòu)清晰可見，呈空泡樣，不著色。

（二）麥松三色（Masson　Trichrome）染色

主要用以顯示或區(qū)分各種纖維成分，觀察新生軟骨組織內(nèi)的膠原沉積、分布及排列方式。上述HE染色相應(yīng)觀察內(nèi)容也同樣適用于麥松三色染色。具體染色方法大致如下。

1．試劑配制

（1）Regaud蘇木精染液：蘇木精1g、95%乙醇10ml，甘油10ml，蒸餾水80ml。

（2）麗春紅酸性復(fù)紅橘黃G液：麗春紅0．7g、酸性復(fù)紅0．3g，橘黃G　2g，蒸餾水99ml，冰醋酸1ml。

（3）亮綠染液：亮綠2g，冰醋酸2ml，蒸餾水98ml。

（4）磷鎢酸溶液：磷鎢酸5g，蒸餾水100ml。

（5）醋酸液：冰醋酸1ml，蒸餾水99ml。

（6）天青－A液：天青－A　1g，蒸餾水100ml。

2．染色程序

（1）切片脫蠟至水，天青－A 液染色5min。

（2）Regaud蘇木精液染色5min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，入自來水返藍(lán)。

（3）麗春紅酸性復(fù)紅橘黃G液1份、1%醋酸液9份，染色5min。

（4）不經(jīng)水洗，5%磷鎢酸液分化10min。

（5）亮綠染液染色20～30min。

（6）迅速用無水乙醇清洗，二甲苯透明，中性樹膠封固。

3．染色結(jié)果　膠原纖維呈綠色，其他軟骨基質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)黑色。

（三）Ⅱ型膠原免疫組化染色

主要用于軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原表達(dá)的鑒定，是確定軟骨組織特異性的最重要指標(biāo)之一。具體方法如下。

1．石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；PBS漂洗3次，3min／次；加3%過氧化氫溶液，置濕盒內(nèi)37℃孵育30min。

2．0．4%胃蛋白酶（0．1mol／L鹽酸配制）37℃濕盒內(nèi)消化30min，充分暴露抗原位點，PBS漂洗3次，3min／次。

3．滴加10%正常滅活羊血清（用10%牛血清清蛋白液稀釋），置濕盒內(nèi)37℃孵育30min，棄去液體，直接滴加第一抗體（第一抗體用0．5%牛血清清蛋白1∶100～200稀釋），置濕盒內(nèi)37℃孵育1～2h或4℃冰箱內(nèi)過夜（14～18h）。

4．PBS漂洗3次，3min／次　滴加多聚物酶標(biāo)記的第二抗體；PBS漂洗3次，3min／次。

5．3，3－二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液（由DAB稀釋液將DAB原液稀釋50倍配制，應(yīng)新鮮配制）顯色10～20min（鏡下控制顯色時間）。

6．顯色后組織切片置流水中終止反應(yīng)；細(xì)胞核襯染（蘇木精染色至細(xì)胞核呈藍(lán)色）；常規(guī)脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

7．染色結(jié)果，軟骨基質(zhì)呈棕黃色顯色反應(yīng)，主要分布于軟骨陷窩周圍及細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)。

（四）甲苯胺藍(lán)染色

主要用于軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖的染色，也是確定軟骨組織特異性的重要指標(biāo)之一。具體方法如下。

1．甲苯胺藍(lán)染液配制　甲苯胺藍(lán)1．0g，研磨至無明顯顆粒，溶于100ml　70%乙醇，定性濾紙過濾備用。

2．染色程序?、偾衅撓炛了妆桨匪{(lán)染液染色20～30min；②蒸餾水沖洗至出現(xiàn)紫色異染反應(yīng)；③無水乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

3．染色結(jié)果　軟骨基質(zhì)呈深紫色（異染現(xiàn)象）至深藍(lán)色，纖維組織基本不著色，骨組織呈淺藍(lán)色。

五、組織工程化軟骨檢測

技術(shù)實驗要點

1．上面介紹的幾種方法是適用于各類軟骨組織檢測的較為通用的方法。不同類型軟骨在體內(nèi)存在部位不同，功能及組成各異，又有其各自特殊的評價方法。如彈性軟骨中含有較多的彈力纖維，可以通過彈力纖維染色（鐵碘蘇木精－三氯化鐵染色）清楚地顯示出來；半月板纖維軟骨中Ⅰ型膠原也是其主要的膠原成分之一，可以通過免疫組化染色或偏光顯微鏡清楚地顯示出其表達(dá)及排列方式；而對于關(guān)節(jié)透明軟骨，Ⅹ型膠原表達(dá)則是其肥大軟骨細(xì)胞的重要特征。

2．組織工程技術(shù)再生的軟骨或修復(fù)的軟骨缺損，能否真正達(dá)到正常軟骨組織的形態(tài)并具備相應(yīng)功能，必須通過多方面的檢測與評價才能得出較為客觀的結(jié)論。上述各種檢測方法均必須以正常軟骨作為陽性對照，以此判斷組織工程化軟骨與正常軟骨在形態(tài)及功能等方面的相似程度，只有這樣才能發(fā)現(xiàn)組織工程技術(shù)構(gòu)建軟骨的不足之處，以便有的放矢地進(jìn)行改進(jìn)和完善，最終實現(xiàn)軟骨形態(tài)與功能的完全再生。

（上海第二醫(yī)科大學(xué)第九人民醫(yī)院劉　偉　周廣東）