基因工程表達(dá)的蛋白質(zhì)的存在形式可能會(huì)是：①在細(xì)胞質(zhì)中，可溶；②包涵體形式，不可溶；③從細(xì)胞中分泌到培養(yǎng)基中；④分泌到周質(zhì)間隙；⑤與細(xì)胞器或膜組分相關(guān)的。其存在形式會(huì)影響得到純化起始材料所用的提取方式。

使用基因工程的方法進(jìn)行提取、純化蛋白質(zhì)的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是：可以在蛋白質(zhì)的氨基端或羧基端加入標(biāo)簽序列（tag sequence），然后利用這些標(biāo)簽序列的性質(zhì)進(jìn)行純化，常用的標(biāo)簽序列有：6×His，可用鎳柱純化；GST，可以用含有谷胱甘肽的柱子純化。

這些蛋白質(zhì)的表達(dá)方式可能會(huì)是：①正常的、成熟的、天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)；②含有天然的前導(dǎo)肽，這種肽會(huì)被正常地加工處理；③與一種肽融合表達(dá)，這種肽對(duì)于蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)是非天然的；④缺乏糖基化或其他翻譯后修飾，或未正確折疊。其表達(dá)方式會(huì)影響純化所用的方法。

無(wú)論蛋白質(zhì)的表達(dá)形式如何，分離這些蛋白質(zhì)的基本流程是一致的，首先是收集細(xì)菌、裂解、過(guò)柱純化（或吸附純化）、檢測(cè)等。在這里，將介紹含有6×His標(biāo)簽蛋白的純化。

目前關(guān)于含6×His蛋白質(zhì)純化的介質(zhì)有很多種，在這里簡(jiǎn)單介紹一下Merck 公司的NTA His?Bind 樹(shù)脂純化方法。

一、可溶性表達(dá)蛋白質(zhì)的純化

【操作步驟】

二、以包涵體形式表達(dá)的蛋白質(zhì)純化

這種蛋白質(zhì)與可溶性形式的提取與純化前面步驟是相同的，只是從收集靶標(biāo)蛋白質(zhì)以后不同，包涵體是以不溶形式存在的，需要進(jìn)行變性處理，才能與樹(shù)脂結(jié)合。

蛋白質(zhì)提取所用的緩沖液組成成分見(jiàn)表11-2。

表11-2 蛋白質(zhì)提取所用的緩沖液組成成分

三、常見(jiàn)問(wèn)題

1.純化的蛋白質(zhì)中含有較多的雜蛋白質(zhì) 盡管大腸桿菌中含有相鄰連續(xù)組氨酸殘基的蛋白不多，但一些蛋白質(zhì)也可以與Ni離子微弱結(jié)合，為了去除多余的雜蛋白，可以采取以下措施：①在裂解緩沖液中加入一定量的β-ME（β-巰基乙醇，使用Ni-NTA樹(shù)脂時(shí)）或DTT（二硫蘇糖醇，使用Ni-IDA樹(shù)脂時(shí)）；②增加漂洗緩沖液的咪唑緩沖液的濃度到50mmol/L；在包涵體形式蛋白純化時(shí)，可以降低漂洗緩沖液的pH為6.0，以去除雜蛋白。

2.純化的效率低 在蛋白質(zhì)表達(dá)量比較豐富時(shí)，出現(xiàn)此問(wèn)題，可能的原因是洗脫的條件比較溫和，尤其是有些蛋白質(zhì)的氨基端和羧基端都加入了His標(biāo)簽，此時(shí)最好以pH 梯度或咪唑梯度洗脫，確定最佳洗脫條件。

（張 寶）