提取蛋白質(zhì)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)通常要求：①蛋白質(zhì)完整性好，不被降解，能夠反映組織的確切表達(dá)情況；②一些蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)要保證其足夠的活性，實(shí)驗(yàn)條件不能損傷蛋白質(zhì)的活性，例如分析粗提物中的酶活性。為了滿足上述要求，在蛋白質(zhì)提取過程中需要注意以下幾個(gè)原則。

1．選擇適當(dāng)方法進(jìn)行細(xì)胞的破碎 除去體液蛋白質(zhì)，大多蛋白位于細(xì)胞內(nèi)，所以在提取細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)時(shí)，首先需要選擇合適的方法進(jìn)行破碎細(xì)胞。破碎細(xì)胞的常用方法包括以下幾種。

（1）高速組織搗碎法：將材料配成稀糊狀液，放置于筒內(nèi)約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調(diào)速器先撥至最慢處，開動(dòng)開關(guān)后，逐步加速至所需速度。此法適用于動(dòng)物內(nèi)臟組織、植物肉質(zhì)種子等。

（2）玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置于管中，再套入研桿來回研磨，上下移動(dòng)，即可將細(xì)胞研碎，此法細(xì)胞破碎程度比高速組織搗碎機(jī)為高，適用于量少和動(dòng)物臟器組織。

（3）超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶。

（4）反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在–20℃以下冷凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。

方法的選擇要因地制宜，同時(shí)要兼顧到靶蛋白的特性、實(shí)驗(yàn)的要求等諸多因素，進(jìn)行綜合考慮，確定最佳的方法。

2．根據(jù)所用材料選擇合適的裂解緩沖液 上述破碎細(xì)胞的方法并不十分徹底，一些蛋白質(zhì)仍然與膜、DNA或RNA結(jié)合，為了使蛋白更好地分離，進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)，仍需化學(xué)裂解液進(jìn)行處理。裂解液中常含有去污劑（如SDS、NP40或Triton X等）、去氧膽酸鈉等。細(xì)菌細(xì)胞壁較厚，采用溶菌酶處理效果更好。

3．蛋白質(zhì)提取步驟一般在冰上或4℃進(jìn)行 由于細(xì)胞中含有大量的蛋白酶，為了保證所提取的蛋白不被降解，降低溫度是抑制降解反應(yīng)的一個(gè)重要措施。在提取蛋白質(zhì)時(shí)要盡可能地在低溫下進(jìn)行。尤其是采用物理方法破碎細(xì)胞時(shí)，更應(yīng)注意保持低溫。

4．在提取過程中要加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?應(yīng)用蛋白酶抑制是抑制蛋白酶活性重要的方法。由于蛋白酶種類非常多，而一種蛋白酶抑制劑只對某一類蛋白酶起作用，因此通常是復(fù)合使用蛋白酶抑制劑。一些公司常將常用的蛋白酶抑制劑做成“雞尾酒（cocktail）”，臨用時(shí)加入裂解緩沖液中。例如，胃蛋白酶抑制劑（pepstatin）、亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、抑肽酶（胰蛋白酶抑制劑，aprotinin）等，能夠強(qiáng)烈抑制所有蛋白酶的活性（如絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶）；苯丁抑制劑（bestatin）能抑制氨基酸多肽酶；Pepstatin A則對天冬氨酸蛋白酶有較好的抑制作用。PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟）為常用的蛋白酶抑制劑（配制時(shí)需用異丙醇溶解）。