基因表達的基本內(nèi)容是RNA合成與加工和蛋白質(zhì)合成與加工，這些反應(yīng)是通過蛋白質(zhì)與核酸的相互作用而精確進行的，如RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子、延長因子與DNA的相互作用，核糖體和翻譯起始因子、終止因子與mRNA的相互作用等。所謂基因表達調(diào)控，實際上就是調(diào)節(jié)和控制上述蛋白質(zhì)與核酸相互作用的過程。調(diào)控的分子機制實際上是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與核酸之間的相互作用。因此，了解與調(diào)控相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點及相互作用的特點有助于了解基因表達調(diào)控的基本機制。

在基因內(nèi)和基因外都有一些特定的DNA序列，與結(jié)構(gòu)基因表達調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合，這些特定的DNA序列稱為順式作用元件（cis-acting elements），亦稱為順式調(diào)控元件。簡單來說，順式作用元件就是指影響同一分子內(nèi)基因表達活性的DNA序列。在原核生物中主要包括啟動子、阻遏蛋白結(jié)合位點、正調(diào)控蛋白結(jié)合位點、增強子等。

另外，在原核生物和真核生物細胞中，還存在有一些能夠與順式作用元件特異性結(jié)合、并對基因表達的轉(zhuǎn)錄起始過程有調(diào)控作用的蛋白質(zhì)，稱為基因特異性轉(zhuǎn)錄因子（gene specific transcription factors），在原核生物中，對基因表達有激活作用的蛋白質(zhì)稱為激活蛋白或正調(diào)控蛋白，對基因表達有抑制作用的蛋白質(zhì)稱為阻遏蛋白。

（一）啟動子的結(jié)構(gòu)特點及其功能

啟動子（promoter）是RNA聚合酶特異性識別、結(jié)合和啟動轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，啟動子具有方向性，位于轉(zhuǎn)錄起始點上游，本身并不被轉(zhuǎn)錄。每一個基因都具有啟動子，個個基因的啟動子序列具有較高的同源性，但并不一定完全一樣。

1．啟動子決定轉(zhuǎn)錄方向及模板鏈 一個基因中DNA雙鏈的堿基對的順序數(shù)，是按照含有RNA序列信息的DNA鏈，即編碼鏈的上、下游方向確定的。DNA鏈中與RNA鏈5′端的第一個核苷酸對應(yīng)的堿基標(biāo)記為＋1（圖4-12），由此堿基向上游（向左）的堿基順序數(shù)為負（-1，-2，…），向下游（向右）的堿基順序數(shù)為正（＋2，＋3，…）。

圖4-12　原核基因啟動子的結(jié)構(gòu)

E．coli的啟動子區(qū)長40～60bp，至少包括3個功能區(qū)。一是起始部位（initiation site），即＋1區(qū)；二是結(jié)合部位（binding site），位于-10區(qū)，為RNA聚合酶與啟動子牢固結(jié)合的位點，該區(qū)有一最保守的六連體，其共有序列為TATAAT，因其是1975年由Pribnow首先發(fā)現(xiàn)，故又稱Pribnow盒（Pribnow box）；三是識別部位（recognition site），位于-35區(qū)，該區(qū)共有序列為TTGACA。許多實驗證實，-35區(qū)是RNA聚合酶對轉(zhuǎn)錄起始的辨認位點?；蜣D(zhuǎn)錄時，σ因子識別并結(jié)合-35區(qū)和-10區(qū)，全酶結(jié)合DNA后覆蓋的區(qū)域是-40～＋20，RNA聚合酶的移動方向是沿著模板鏈的3′→5′，即啟動子決定著轉(zhuǎn)錄的方向。如果啟動子倒轉(zhuǎn)了方向（見后面的倒位蛋白調(diào)控），RNA聚合酶的移動也隨之倒轉(zhuǎn)，原來轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)基因就不再被轉(zhuǎn)錄。

2．啟動子決定轉(zhuǎn)錄效率 各種原核基因啟動子特殊區(qū)域內(nèi)，在轉(zhuǎn)錄起始點上游-10及-35區(qū)常存在一些相似序列，稱為一致序列（consensus sequences）。通過比較大量的E．coli啟動子，表明這兩個序列中各堿基的出現(xiàn)頻率為：-35：T82G78A65C54A95；-10：T80A95T45A60 A50T96（下角標(biāo)數(shù)字表示核苷酸在所有啟動子中出現(xiàn)的頻率）。顯然，如果一個基因的啟動子序列與一致序列越相近，則該啟動子的效率就越高，即屬于所謂的強啟動子；相反，如果一個基因的啟動子序列與上面的一致序列相差越大，則該啟動子的效率就越低，即屬于所謂的弱啟動子。不同基因在啟動子序列上的差異實際也構(gòu)成了調(diào)節(jié)基因表達的一種手段。

RNA聚合酶與啟動子結(jié)合及啟動轉(zhuǎn)錄的效率在很大程度上取決于-10區(qū)和-35區(qū)的一致序列及其間隔距離以及它們與轉(zhuǎn)錄起始點的距離。若以上兩個一致序列的關(guān)鍵堿基發(fā)生突變，可使RNA聚合酶識別、結(jié)合啟動子的能力和啟動轉(zhuǎn)錄效率下降幾個數(shù)量級。突變實驗發(fā)現(xiàn)：-35區(qū)一致序列的突變會降低RNA聚合酶與啟動子識別、結(jié)合的能力，但不影響轉(zhuǎn)錄起始點附近DNA雙鏈的解鏈；而-10區(qū)一致序列的突變不影響RNA聚合酶與啟動子識別、結(jié)合的能力，但可降低轉(zhuǎn)錄起始點附近DNA雙鏈的解鏈速度。識別E．coli啟動子中一致序列的σ因子主要是σ70亞單位。啟動子序列與上述序列越接近，σ70與之結(jié)合的能力越強。

（二）調(diào)控蛋白的結(jié)構(gòu)特點

多肽鏈對特異DNA序列的識別與結(jié)合可通過各種特定結(jié)構(gòu)進行。通過DNA-蛋白質(zhì)相互作用分析，現(xiàn)已鑒定出多種結(jié)合特異DNA序列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)元件，其中最常見者有廣泛存在于原核、真核調(diào)節(jié)蛋白中的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）和鋅指結(jié)構(gòu)（zinc finger，鋅指結(jié)構(gòu)中的兩個Cys，兩個His，或4個都是Cys以配位鍵與Zn2＋相互作用）。這些結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)與DNA序列特異結(jié)合的結(jié)構(gòu)基元（模體），通常是與DNA大溝接觸。但也有例外，例如大腸埃希菌的整合宿主因子通過其結(jié)構(gòu)中所含的反平行β伸展選擇性地與DNA小溝相互作用，細菌組蛋白樣蛋白通過環(huán)狀β折疊結(jié)構(gòu)與DNA小溝結(jié)合。

在lac阻遏蛋白、CAP、trp阻遏蛋白、λ阻遏蛋白等基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白中，都有一個類似的結(jié)構(gòu)模體（structural motif），即HTH結(jié)構(gòu)。不同蛋白因子的HTH結(jié)構(gòu)并不完全一樣，但與各自的靶位點的結(jié)合都如同鎖與鑰匙一樣匹配。

（三）操縱序列和阻遏蛋白

1．操縱序列（operator） 亦稱為操縱基因（實際上并不是一個基因），是阻遏蛋白識別與結(jié)合的一小段DNA序列，操縱序列緊接在啟動子下游，與啟動子交錯重疊。

2．阻遏蛋白 是一類在轉(zhuǎn)錄水平對基因表達產(chǎn)生負調(diào)控作用的蛋白質(zhì)，它可以識別、結(jié)合操縱序列，抑制開放啟動子復(fù)合物的形成，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)負性調(diào)節(jié)。當(dāng)阻遏蛋白與DNA結(jié)合后，RNA聚合酶雖然仍然可以與啟動子結(jié)合，但不能形成開放的啟動子復(fù)合物，不能啟動轉(zhuǎn)錄，這種作用稱為阻遏（repression）；相反，當(dāng)特定的信號分子與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白變構(gòu)失活，與DNA解聚，稱為去阻遏，或脫阻遏（derepression）。

阻遏蛋白都可以與信號分子結(jié)合而發(fā)生變構(gòu)，在不同構(gòu)象時，阻遏蛋白或者與DNA結(jié)合，或者與DNA解離。在可誘導(dǎo)型操縱子中，信號分子使阻遏物從DNA釋放下來，解除對轉(zhuǎn)錄的抑制作用；在可阻遏型操縱子中，信號分子使阻遏物結(jié)合DNA，抑制轉(zhuǎn)錄。在兩種情況下，阻遏蛋白結(jié)合于DNA后都是抑制轉(zhuǎn)錄，這種類型的基因表達調(diào)控稱為負調(diào)控。

（1）可誘導(dǎo)型操縱子：E．coli的乳糖操縱子（lac operon）是一種典型的可誘導(dǎo)型操縱子，之所以說是誘導(dǎo)型操縱子是因為乳糖作為誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)其操縱子發(fā)生轉(zhuǎn)錄。乳糖操縱子含Z、Y及A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、半乳糖苷透酶（β-galactoside permease，也稱乳糖透酶）和半乳糖苷乙?；福╣alactoside acetylase），此外還有操縱序列O、啟動序列P及調(diào)節(jié)基因I。I基因編碼產(chǎn)生阻遏蛋白，阻遏蛋白是由相同亞基構(gòu)成的四聚體。在沒有乳糖的條件下，阻遏蛋白能與操縱序列結(jié)合，操縱序列為回文序列，位于-7至＋28區(qū)，與啟動子有部分重疊。阻遏蛋白與操縱序列結(jié)合后，抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)有乳糖存在時，lac操縱子即可被誘導(dǎo)開放，但實際上真正的誘導(dǎo)劑并不是乳糖本身，而是由乳糖代謝產(chǎn)生的別乳糖與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，變構(gòu)后的阻遏蛋白不能與操縱序列結(jié)合，不能阻止開放的啟動子復(fù)合物的形成，RNA聚合酶開始轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)基因（圖4-13）。

異丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside，IPTG）是一種人工合成的乳糖類似物，能夠迅速和持續(xù)地刺激乳糖操縱子結(jié)構(gòu)基因的表達，它本身并不能被降解，因此，被稱為安慰誘導(dǎo)劑。在基因工程中，β-半乳糖苷酶的一種人工顯色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，Xgal）與IPTG的配合使用常用來篩選重組體。

（2）可阻遏操縱子：E．coli中色氨酸操縱子（trpoperon）是一種典型的可阻遏型操縱子，色氨酸作為輔阻遏物與阻遏蛋白結(jié)合而阻止色氨酸操縱子的表達。色氨酸操縱子的結(jié)構(gòu)基因包括編碼5種酶的基因E、D、C、B、A，參與色氨酸的合成代謝，另外，在trp E的上游含有一段前導(dǎo)序列（trp L），編碼一段寡肽，其內(nèi)部含有弱化子序列。調(diào)控元件有啟動子和操縱序列。色氨酸操縱子表達的調(diào)控有兩種方式，一種通過阻遏蛋白的調(diào)控；另一種是通過衰減子作用（attenuation），此處介紹阻遏蛋白的作用。

圖4-13　大腸埃希菌乳糖操縱子阻遏蛋白的作用

色氨酸操縱子阻遏物是由色氨酸操縱子上游R基因所表達的產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量為78ku，稱Trp阻遏蛋白（Trp repressor protein R，TrpR），為二聚體蛋白質(zhì)。單獨的TrpR并不能與色氨酸操縱序列結(jié)合，因此，如果細胞內(nèi)的色氨酸濃度很低，TrpR無活性，色氨酸操縱子就處于開放狀態(tài)，參與色氨酸合成的酶就會表達，為細胞合成必需的色氨酸。當(dāng)細胞內(nèi)的色氨酸累積到一定水平后，色氨酸作為輔阻遏物與TrpR結(jié)合，誘導(dǎo)其構(gòu)象變化使之激活，隨后，TrpR-Trp與操縱序列結(jié)合，阻遏結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄（圖4-14）。

圖4-14　色氨酸操縱子阻遏蛋白的作用

（四）正調(diào)控蛋白結(jié)合位點及激活蛋白

與負調(diào)控相反，一些調(diào)控蛋白結(jié)合于特異DNA序列后可促進基因的轉(zhuǎn)錄，這種基因表達調(diào)控的方式稱為正調(diào)控。E．coli中的一些弱啟動子，本身結(jié)合RNA聚合酶的作用很弱，對于這些啟動子來說，正調(diào)控作用是十分重要的。轉(zhuǎn)錄的激活是通過一種激活蛋白結(jié)合于鄰近的特異DNA序列，提高RNA聚合酶與啟動序列的結(jié)合能力，促進轉(zhuǎn)錄的啟動。

E．coli的分解代謝物基因激活蛋白（catabolite gene activator protein，CAP）是一種研究得較多的激活蛋白，這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號傳遞給許多操縱子，使細菌在缺乏葡萄糖的環(huán)境中可以利用其他碳源。CAP由2個相同的亞基組成，每個亞基含有209個氨基酸殘基，有2個結(jié)構(gòu)域，1個在N端，含有結(jié)合cAMP的位點，另一個在C端，含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，負責(zé)與DNA結(jié)合。CAP本身的活性是由cAMP激活的，當(dāng)cAMP結(jié)合于CAP后，誘導(dǎo)CAP發(fā)生構(gòu)象改變，致使其C端的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋采取合適的取向，從而能夠識別DNA上的結(jié)合位點，激活鄰近基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)cAMP水平降低時，cAMP與CAP解離，CAP轉(zhuǎn)回到無活性的構(gòu)象，并與DNA解離，這將關(guān)閉葡萄糖以外的其他與糖代謝相關(guān)的操縱子。由于CAP的作用依賴于cAMP，因此，也有人將CAP稱為cAMP受體蛋白（cAMP receptor protrin，CRP）。

使用DNA酶Ⅰ-足印法得到了CAP-cAMP與DNA結(jié)合的特異性位點，由26bp組成，位于乳糖操縱子的啟動子緊靠-35區(qū)域的上游，其一致序列是一段不完善的回文序列——TGTGA-N6-TCACA，該位點被稱為CAP位點。CAP-cAMP與CAP位點的結(jié)合可導(dǎo)致周圍的DNA產(chǎn)生小的彎曲，致使自身能夠與RNA聚合酶全酶的α亞基的羧基端相互作用，從而有利于RNA聚合酶與啟動子的結(jié)合以及DNA雙螺旋的局部解鏈，最終促進了下游基因的轉(zhuǎn)錄（圖4-15）。

（五）增強子與激活蛋白

細菌中也存在可稱為增強子的DNA元件，特定的蛋白質(zhì)可與這種元件結(jié)合并激活基因轉(zhuǎn)錄，而這些元件的位置并不影響其功能。

谷氨酰胺合成酶基因（glnA）啟動子是由含有σ54的RNA聚合酶全酶所識別，σ54全酶可以穩(wěn)定地結(jié)合glnA的啟動子，但是不能打開轉(zhuǎn)錄起始部位的DNA雙鏈、形成開放的起始復(fù)合物，所形成的只是“閉合起始復(fù)合物”（closed complex），不能轉(zhuǎn)錄。在啟動子的上游一百多bp處，有兩個ntrC蛋白結(jié)合位點（增強子），正向影響谷氨酰胺基因的表達。ntrC蛋白是大腸埃希菌氮代謝基因的激活蛋白，通過磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)自身活性。非磷酸化的ntrC蛋白也可以與DNA上的ntrC蛋白結(jié)合位點結(jié)合，但對轉(zhuǎn)錄沒有調(diào)控作用。當(dāng)磷酸化的ntrC結(jié)合于上述位點，或結(jié)合在位點上的ntrC蛋白被磷酸化，即可發(fā)揮調(diào)控功能，啟動轉(zhuǎn)錄。ntrC蛋白有一個ATP酶活性結(jié)構(gòu)域，通過水解ATP提供能量，提高RNA聚合酶解開DNA螺旋的能力，形成“開放起始復(fù)合物”（open complex），然后開始轉(zhuǎn)錄（圖4-16）。

ntrC蛋白的調(diào)控活性由ntrB蛋白控制。ntrB蛋白既具有激酶活性，使ntrC磷酸化，又具有磷酸酶活性，使ntrC蛋白去磷酸化。ntrB中有一個調(diào)節(jié)亞基，稱為PⅡ蛋白，兩者結(jié)合時，ntrB以磷酸酶活性為主；兩者解離時，ntrB蛋白則以激酶活性為主。當(dāng)谷氨酰胺缺乏時，細胞內(nèi)α-酮戊二酸／谷氨酰胺的比值增高，可使尿苷酸化酶（uridylating enzyme）激活。該酶催化UMP與PⅡ蛋白結(jié)合，PⅡ蛋白隨之與ntrB解離，使ntrB的激酶活性增高，將ntrC磷酸化。但PⅡ如何去掉UMP，調(diào)節(jié)ntrC去磷酸化，目前尚不清楚。

圖4-15　CAP-cAMP與RNA聚合酶以及乳糖操縱子的相互作用

圖4-16　ntrC蛋白對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用