采用重組DNA技術(shù)，將不同來源的DNA分子在體外進(jìn)行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎(chǔ)上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆（gene cloning）。基因克隆技術(shù)包括把來自不同生物的基因同有自主復(fù)制能力的載體DNA在體外人工連接，構(gòu)建成新的重組DNA，然后送入受體生物中去表達(dá)，從而產(chǎn)生遺傳物質(zhì)和狀態(tài)的轉(zhuǎn)移和重新組合。因此基因克隆技術(shù)又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術(shù)以及基因工程等。基因克隆的主要步驟如下。

1．獲得目的DNA片段　DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內(nèi)的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細(xì)胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機(jī)械切割和核酸限制性內(nèi)切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學(xué)直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，從基因組DNA或cDNA中通過PCR技術(shù)可以獲得目的基因。

2．選擇載體　基因工程載體應(yīng)具有如下基本性質(zhì)。

（1）在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴(kuò)增。

（2）分子量盡可能小，以利于在宿主細(xì)胞中有較多的拷貝，便于結(jié)合更大的外源DNA片段。同時在實(shí)驗(yàn)操作中也不易被機(jī)械剪切而破壞。

（3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因），以賦予宿主細(xì)胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。

（4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn)，為避開外源DNA片段中限制酶位點(diǎn)的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點(diǎn)是位于檢測表型的標(biāo)記基因之內(nèi)可造成插入失活效應(yīng)，則更有利于重組子的篩選。

3．體外重組　即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數(shù)核酸限制性內(nèi)切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當(dāng)載體的多克隆位點(diǎn)便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。當(dāng)目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)表達(dá)時，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點(diǎn)等，可以獲得相應(yīng)的黏末端，然后進(jìn)行連接，此為修飾黏末端連接。

4．導(dǎo)入受體細(xì)胞　載體DNA分子上具有能被原核宿主細(xì)胞識別的復(fù)制起始位點(diǎn)，因此可以在原核細(xì)胞如大腸埃希菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴(kuò)增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。將外源重組DNA分子導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞的方法有轉(zhuǎn)化（transformation），轉(zhuǎn)染（transfection），轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。重組質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化技術(shù)可以導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入。轉(zhuǎn)染效率不高，因此將重組噬菌體DNA或柯斯質(zhì)粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導(dǎo)入到宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)的導(dǎo)入效率要比轉(zhuǎn)染的導(dǎo)入效率高。

5．篩選重組子　從不同的重組DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子中鑒定出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子即陽性克隆的過程就是篩選。目前發(fā)展起來的成熟篩選方法有插入失活法、PCR篩選和限制酶切法、核酸分子雜交法及免疫學(xué)篩選法等。