◎Elisa C. Woodhouse，Kathleen Kelly

長(zhǎng)期以來(lái)，科學(xué)家用遺傳模型，特別是用小鼠模型，來(lái)研究腫瘤轉(zhuǎn)移。其他生物體被用于各種生物過(guò)程的遺傳分析，例如發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞生長(zhǎng)。近來(lái)，遺傳順從(genetically tractable)的非哺乳動(dòng)物模型對(duì)于腫瘤和轉(zhuǎn)移研究的重要性越來(lái)越明顯。果蠅(Drosophila melanogaster)就是一個(gè)這樣的有機(jī)體。

自從20世紀(jì)70年代就已經(jīng)知道在果蠅的特定突變品系中會(huì)產(chǎn)生腫瘤?？茖W(xué)家已經(jīng)了解這些腫瘤的分子基礎(chǔ)，包括在這些品系具體的腫瘤抑制基因突變，在細(xì)胞中產(chǎn)生的缺陷，以及這些異常導(dǎo)致在果蠅中產(chǎn)生腫瘤的方式。用果蠅作為轉(zhuǎn)移模型的最關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)是能夠迅速在體內(nèi)產(chǎn)生突變并評(píng)估其效果。在這一領(lǐng)域，從模型的發(fā)現(xiàn)到基于發(fā)現(xiàn)的研究均已很成熟。在本章將討論果蠅模型的幾個(gè)方面，包括腫瘤抑制基因和人類同源基因、細(xì)胞極性在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用、現(xiàn)今應(yīng)用果蠅理解轉(zhuǎn)移和遷移的方法，以及舉例說(shuō)明通過(guò)應(yīng)用每個(gè)模型所獲得的知識(shí)等。

另一個(gè)正在發(fā)展更有效的遺傳研究的腫瘤模型生物是斑馬魚(Danio rerio)。作為脊椎動(dòng)物，斑馬魚具有比果蠅更加復(fù)雜的生物解剖結(jié)構(gòu)，比無(wú)脊椎動(dòng)物更有利于進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制。斑馬魚以及現(xiàn)有腫瘤模型的應(yīng)用方法將在本章后面加以討論。果蠅和斑馬魚的遺傳模型可以用于研究轉(zhuǎn)移過(guò)程關(guān)鍵步驟中獨(dú)立的部分，其可在小鼠模型和人類腫瘤上得到驗(yàn)證。

2.2.1 果蠅腫瘤模型

(1) 果蠅腫瘤抑制基因突變表型

已在果蠅中發(fā)現(xiàn)了一旦失活即與癌變相關(guān)的腫瘤抑制基因。在果蠅中大量的腫瘤抑制基因功能喪失可導(dǎo)致增生性增長(zhǎng)，只有小部分腫瘤抑制基因的功能喪失才會(huì)導(dǎo)致形成真正腫瘤。這些可致成瘤的腫瘤抑制基因與果蠅的癌及其轉(zhuǎn)移研究才是最相關(guān)的。這些基因的突變除了會(huì)損傷幼蟲的大腦外，還可以引起成蟲器的分化和生長(zhǎng)受阻，幼蟲的囊表皮細(xì)胞將會(huì)產(chǎn)生特定的成年結(jié)構(gòu)，如眼、腿和觸角。這些致瘤形成的腫瘤抑制基因已被廣泛的研究，包括lgl (lethal giant larvae)［1］、dlg (discs large)［2］、brat (brain tumor)［3］和scrib(scrib-ble)［4］。這些基因的突變表型非常相似，并且都是在幼蟲的后期致死。幼蟲發(fā)育為過(guò)度成長(zhǎng)的成蟲器，其結(jié)構(gòu)混亂、多層。過(guò)度成長(zhǎng)的幼蟲大腦神經(jīng)細(xì)胞缺乏分化，神經(jīng)母細(xì)胞數(shù)量增多。

過(guò)去數(shù)年的研究顯示，這些突變的果蠅腫瘤抑制基因通過(guò)破壞細(xì)胞極性，從而導(dǎo)致幼蟲腦中成瘤。有些腫瘤抑制基因已被證明會(huì)擾亂神經(jīng)母細(xì)胞譜系，導(dǎo)致產(chǎn)生具有轉(zhuǎn)移潛能的過(guò)度自我更新的神經(jīng)母細(xì)胞和腫瘤(后面將會(huì)討論到)。神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤模型系統(tǒng)的基本生物學(xué)原理的理解促成了我們現(xiàn)在感興趣的假說(shuō):具有轉(zhuǎn)移能力的、可自我更新的腫瘤細(xì)胞與具有自我更新能力的普通干細(xì)胞具有相同特性。

(2) 細(xì)胞極性與進(jìn)展中的果蠅腫瘤抑制基因

細(xì)胞極性的喪失是腫瘤發(fā)生的重要一步。Lgl蛋白和Brat蛋白在保持細(xì)胞極性作用和在任何一種蛋白缺失的情況下觀察到腫瘤發(fā)生方面的研究，已經(jīng)闡明了控制這一過(guò)程的某些分子機(jī)制。幼蟲神經(jīng)母細(xì)胞通常不對(duì)稱分裂為兩個(gè)子細(xì)胞，即來(lái)源于底端的神經(jīng)節(jié)母細(xì)胞(GMC)和一個(gè)來(lái)源于頂端的較大的神經(jīng)母細(xì)胞。GMC再次分裂，產(chǎn)生了兩個(gè)終末分化的神經(jīng)細(xì)胞，而自我更新的神經(jīng)母細(xì)胞繼續(xù)沿襲產(chǎn)生一個(gè)GMC和一個(gè)神經(jīng)母細(xì)胞(圖2-3)。在果蠅的神經(jīng)母細(xì)胞中，不對(duì)稱分裂是通過(guò)將細(xì)胞頂部和底部組分分裂為各自的皮層區(qū)域來(lái)維持。神經(jīng)母細(xì)胞系依賴于GMC中神經(jīng)母細(xì)胞基因表達(dá)下調(diào)，以及隔離GMC神經(jīng)決定子。Lgl被發(fā)現(xiàn)與PAR復(fù)合物的相互作用(Bazooka/Par-6/aPKC，in Drosophila)，用于調(diào)節(jié)頂部/底部細(xì)胞極性［5，6］。Lgl和PAR復(fù)合蛋白a PKC的控制是通過(guò)其相互抑制作用實(shí)現(xiàn)的。定位于頂部的Lgl被a PKC磷酸化，因構(gòu)象變化導(dǎo)致其被釋放［7］，限制了激活的Lgl到達(dá)神經(jīng)母細(xì)胞的底部［5］。激活的Lgl蛋白在底部區(qū)域可抑制a PKC的活性?；驍?shù)據(jù)表明，Lgl調(diào)節(jié)a PKC，而a PKC通過(guò)控制神經(jīng)細(xì)胞的特定基因和神經(jīng)元細(xì)胞命運(yùn)決定子，從而直接促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的自我更新［8］。促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)的蛋白質(zhì)定位在底部。Miranda蛋白［9，10］和它的裝載蛋白、轉(zhuǎn)錄因子Prospero［11，13］是定位于基底神經(jīng)細(xì)胞決定子的關(guān)鍵因子。Brat蛋白通過(guò)與Miranda蛋白聯(lián)合作為荷重蛋白而定向底部［14］。Prospero蛋白定位在底部需要Brat，可能是通過(guò)穩(wěn)定Miranda蛋白和Prospero蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)的。在缺乏Brat蛋白功能的突變體中，底部子細(xì)胞表達(dá)Miranda蛋白，但不表達(dá)Brat和Prospero蛋白。brat突變的GMC子細(xì)胞保持表達(dá)一些神經(jīng)母細(xì)胞特定蛋白，并且高頻率地轉(zhuǎn)變成為神經(jīng)母細(xì)胞(圖2-3)［14］，使異常細(xì)胞的自我更新以分化為代價(jià)，這會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)與lgl突變體中相似的表型。其他細(xì)胞極性決定子的突變體也可導(dǎo)致果蠅侵襲性腫瘤的發(fā)生。幼蟲Wain組織中存在pins、miranda、numb或prospero(pros)基因突變，在移植中會(huì)在遠(yuǎn)端位點(diǎn)形成繼發(fā)腫瘤(即轉(zhuǎn)移)［15］。

圖2-3 Brat可阻礙神經(jīng)母細(xì)胞的自我更新并促進(jìn)GMC的分化

注: 上圖所示:野生型神經(jīng)母細(xì)胞分隔 Miranda、Brat 和Prospero(Pros)成為GMC。在GMCS中，Miranda分解，Brat在胞質(zhì)中，Pros在細(xì)胞核中，神經(jīng)母細(xì)胞基因下調(diào)。GMCs有絲分裂為兩個(gè)神經(jīng)元。下圖所示:在brat突變體底部，神經(jīng)母細(xì)胞分隔Miranda而不分隔Brat和Pros成為GMC。GMC保持神經(jīng)母細(xì)胞基因表達(dá)并表現(xiàn)出延遲分化，有一些最終成為神經(jīng)元，還有一些似乎擴(kuò)大為增殖的神經(jīng)母細(xì)胞。圖中顯示brat突變體有異常神經(jīng)母細(xì)胞。單腦葉或brat11/brat1196小時(shí)后，在固定前幼蟲側(cè)剖面用神經(jīng)母細(xì)胞標(biāo)記Miranda(Mira) 、Deadpan(Dpn)和神經(jīng)元標(biāo)記Elav染色并進(jìn)行4小時(shí)BrdU脈沖，評(píng)估增殖情況。帶尾箭頭標(biāo)注的是神經(jīng)母細(xì)胞;三角箭頭標(biāo)注的是GMC［14］。

(3) 果蠅腫瘤抑制基因的人類同源基因與致癌作用

已證明在人類腫瘤發(fā)展過(guò)程中也會(huì)發(fā)生頂部-底部決定子的分隔。人類同源a PKC和Lgl、a PKCζ和Hugl-1已被證明與多種上皮癌有關(guān)［16］，Hugl-1表達(dá)水平的下調(diào)與大腸癌、黑色素瘤的形成和發(fā)展有關(guān)［17］。Hugl-1缺失與內(nèi)皮細(xì)胞癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后差也有關(guān)［18］。這些蛋白的適當(dāng)定位也似乎是抑制腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵。在卵巢腫瘤的黏液和漿液中已發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤定位的aPKCζ和Hug-1蛋白。在黏液和漿液性癌中，aPKCζ和Hugl-1在細(xì)胞質(zhì)中，而aPKCζ的頂部特異性則消失。在卵巢癌［19］和肺癌［20］中也發(fā)現(xiàn)aPKCζ表達(dá)上調(diào)。其他兩個(gè)人類同源果蠅腫瘤抑制基因discslarge和scribble與結(jié)腸癌發(fā)展有關(guān)。hDlg和h Scrib兩種蛋白表達(dá)水平的下降，與細(xì)胞極性和組織構(gòu)造的損傷有關(guān)。以往研究這些蛋白與人類癌癥的關(guān)聯(lián)顯示，Dlig和Scribble蛋白以降解HPVE6為目標(biāo)［21，22］。最近一項(xiàng)研究比較全部基因在多種腫瘤細(xì)胞系和非致瘤親本細(xì)胞系中表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一種已知的在哺乳動(dòng)物中可以調(diào)控果蠅細(xì)胞極性的蛋白，即Crumbs，其在腫瘤細(xì)胞株中顯著下調(diào)。當(dāng)小鼠腎臟上皮細(xì)胞中crumbs3基因表達(dá)被抑制后，頂部-底部極性和接觸性抑制生長(zhǎng)會(huì)被打亂?；虮磉_(dá)的修復(fù)可抑制這些作用，并且抑制腫瘤細(xì)胞株的遷移和轉(zhuǎn)移［23］。兩者證據(jù)表明，在果蠅中控制兩極化、維持組織的完整性和構(gòu)架，以及抑制轉(zhuǎn)移的機(jī)制在哺乳動(dòng)物腫瘤中是保守的，如果控制這些過(guò)程可能有助于人類癌癥的治療。

(4) 果蠅腫瘤的轉(zhuǎn)移

已創(chuàng)建可視并在繼發(fā)位點(diǎn)操縱腫瘤生長(zhǎng)的果蠅模型，以便更好地了解腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中重要分子的基本原理。以原發(fā)瘤轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的腫瘤生長(zhǎng)作為參考，用以分析侵襲、轉(zhuǎn)移和定位的特性(圖2-4)。本質(zhì)上講，存在兩種使用果蠅腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)移模型:一種方法涉及將腫瘤抑制基因突變體的組織移植到野生型組織，第二種辦法是原位觀察轉(zhuǎn)移。

(5) 移植轉(zhuǎn)移模型

移植轉(zhuǎn)移模型在初步研究中的應(yīng)用，鑒定了lethal giant larvae基因是腫瘤抑制基因突變體［25］。隨后對(duì)方法進(jìn)行了修改，引入了腫瘤細(xì)胞標(biāo)記物β-半乳糖苷酶，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移可以定量。該方法的基本操作和原理為:把從突變幼蟲分離的供體組織腹部注射到野生型成體蠅宿主，培養(yǎng)一段時(shí)間，其間腫瘤生長(zhǎng)并經(jīng)歷了轉(zhuǎn)移。成體宿主用β-半乳糖苷酶活性染色，在遠(yuǎn)離注射點(diǎn)處確認(rèn)腫瘤源性細(xì)胞(圖2-4)。

利用這種方法發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的lgl(87%)和brat(84%)腦組織碎片和比例可觀的dlg(22%)腦組織碎片發(fā)生了轉(zhuǎn)移，還有l(wèi)gl(43%) 和dlg(53%)的成蟲盤腫瘤也發(fā)生了轉(zhuǎn)移。移植后的腫瘤生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析表明，源于一小群細(xì)胞的腫瘤僅代表1%～2%的移植腫瘤組織細(xì)胞。

使用將標(biāo)記的果蠅腫瘤組織注射到成體宿主的移植方法，可以用于確定組織轉(zhuǎn)移需要的基因［26］。使用隨機(jī)元素P誘變，分離出破壞了lgl細(xì)胞轉(zhuǎn)移的特定突變，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了受影響的基因。研究發(fā)現(xiàn)，lgl細(xì)胞的腫瘤形成和轉(zhuǎn)移需要semaphorin5c基因。Semaphorin5c基因是Semaphorin家族成員，是重要的軸突導(dǎo)向分子［27］。另外一個(gè)突變apontic基因特別影響轉(zhuǎn)移。apontic基因已被證明作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，是胚胎發(fā)育遷移中所必需的［28］。第三個(gè)突變激活了pointed基因，一個(gè)Ets域轉(zhuǎn)錄因子，是導(dǎo)管細(xì)胞遷移及其他方面發(fā)展所必需的［29］。與野生型相比，縮短了注射這些腫瘤細(xì)胞宿主的生存時(shí)間。

圖2-4 來(lái)源于致死巨人癥幼體、腦瘤和discslarge移植產(chǎn)生的繼發(fā)腫瘤，攜帶miranda基因突變體克隆的腦碎片或突變體腦碎片

注: (A) 腦瘤、頭部或胸部繼發(fā)腫瘤，全標(biāo)本包埋。(B)discs large、卵巢繼發(fā)腫瘤(箭頭)，全標(biāo)本包埋。(C)discs large、腿部繼發(fā)腫瘤(箭頭)，全標(biāo)本包埋。(D)致死巨人癥幼體、頭部繼發(fā)腫瘤(箭頭)，部分標(biāo)本。(E)致死巨人癥幼體，腔內(nèi)腫瘤(箭頭)，部分標(biāo)本。(F)discslarge、胸部繼發(fā)腫瘤，部分標(biāo)本(A～C的比例尺為100nm，D～F的為50nm)。(G)標(biāo)記GFP及mirazz17的幼腦碎片，在植入兩周后體積增長(zhǎng)了數(shù)倍，一大團(tuán)植入組織(綠色)在宿主中，一個(gè)較小的定植腫瘤(黃色箭頭)分布在距離初始植入位點(diǎn)(黑色箭頭)較遠(yuǎn)的位置［24，15］。

由于果蠅宿主有一個(gè)開(kāi)放性循環(huán)系統(tǒng)，細(xì)胞有可能在不跨越組織障礙的情況下從注射部位遷移，因此，接受腫瘤組織移植的宿主可能具有被動(dòng)和主動(dòng)遷移細(xì)胞的混合。因此，對(duì)移植轉(zhuǎn)移分析作了進(jìn)一步修改，以觀察宿主卵巢管中的微轉(zhuǎn)移來(lái)專門研究具有侵襲行為的細(xì)胞(圖2-5)［30］。這種方法可以用來(lái)顯示來(lái)源于lgl和brat組織有不同特性的轉(zhuǎn)移瘤。例如，卵巢管被lgl腫瘤細(xì)胞入侵的頻率隨著體內(nèi)培養(yǎng)時(shí)間上升，然而來(lái)源于brat腫瘤的微轉(zhuǎn)移則不會(huì)如此。此外，在神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記表達(dá)中，研究者發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于lgl和brat腫瘤的轉(zhuǎn)移細(xì)胞是不同的，來(lái)源于lgl組織的轉(zhuǎn)移細(xì)胞共表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記，而大多數(shù)brat轉(zhuǎn)移細(xì)胞不表達(dá)其中任何一個(gè)。這表明，雖然Lgl和Brat蛋白都是通過(guò)將神經(jīng)母細(xì)胞分裂的平衡狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)度自我更新，從而打亂神經(jīng)細(xì)胞分裂，但轉(zhuǎn)移瘤的分子特性卻不同。移植實(shí)驗(yàn)的另外一個(gè)改進(jìn)［15］，是將腫瘤細(xì)胞用綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記，以區(qū)分成體宿主中的腫瘤細(xì)胞(圖2-4G)。正如前面所示，極性決定因素Pin和Miranda的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。這些腫瘤轉(zhuǎn)移，通過(guò)注射位點(diǎn)的遠(yuǎn)端熒光定位，腫瘤可以在活體內(nèi)可視化，并重新獲得活的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。最重要的是，不經(jīng)染色可以將生物分子從腫瘤細(xì)胞中分離出來(lái)，而不至于損害其完整性。

圖2-5 果蠅腦瘤細(xì)胞在宿主卵巢管中形成微轉(zhuǎn)移。通過(guò)對(duì)包含brat(A)或lgl(B)基因突變體微轉(zhuǎn)移(綠色箭頭)的宿主卵巢管做共聚焦截面，顯示微轉(zhuǎn)移已穿過(guò)上皮鞘肌肉層(紅色)［30］

(6) 原位腫瘤轉(zhuǎn)移模型

另外一個(gè)在果蠅中模擬轉(zhuǎn)移的方法是檢查腫瘤細(xì)胞的原位(機(jī)體內(nèi)部)轉(zhuǎn)移。與移植模型相反，從有機(jī)體中分離出一塊腫瘤組織，其中所有細(xì)胞的腫瘤抑制基因失活。這種原位方法需要在其他正常組織中產(chǎn)生缺乏特定腫瘤抑制基因的細(xì)胞標(biāo)記克隆。這些細(xì)胞在特定條件下在有機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)移。腫瘤模型中的細(xì)胞克隆模仿了人類癌癥，其腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞相鄰，接受正常細(xì)胞環(huán)境的信號(hào)。當(dāng)腫瘤抑制基因scribble的突變體克隆生長(zhǎng)在幼蟲的眼成蟲器上，則突變體克隆不會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)［31］。這與scribble突變體幼蟲相反，scribble突變體幼蟲顯現(xiàn)腫瘤的成蟲盤大腦［4］。然而，當(dāng)與致癌基因ras和notch突變結(jié)合時(shí)，scrib克隆確實(shí)生長(zhǎng)了［31］。這種研究原位克隆腫瘤的方法可用于鑒別促進(jìn)非侵襲性細(xì)胞團(tuán)成為可以遠(yuǎn)處播散腫瘤的基因。一項(xiàng)研究［32］使用了這個(gè)方法，發(fā)現(xiàn)scrib基因的突變以及腫瘤抑制基因lgl和dlg的突變，可導(dǎo)致Rasv12腫瘤的發(fā)展(圖2-6)。這些突變可以導(dǎo)致大的原發(fā)瘤并向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移可以通過(guò)GFP標(biāo)記突變體克隆實(shí)現(xiàn)可視化。在這個(gè)系統(tǒng)中，腫瘤抑制基因不能引起轉(zhuǎn)移腫瘤克隆，可能是由于scrib-克隆周圍存在正常細(xì)胞(圖2-6)。

一個(gè)重要的問(wèn)題是，維持細(xì)胞極性和形態(tài)所必需的其他基因突變是否也會(huì)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。bazooka、stardust和cdc42的突變確實(shí)會(huì)促進(jìn)Rasv12腫瘤的發(fā)展。這種檢測(cè)果蠅腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法已被其他研究采用。另外一個(gè)小組［33］發(fā)現(xiàn)，Rasv12突變細(xì)胞Src水平高表達(dá)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性生長(zhǎng)。作者提出在人類腫瘤中Src水平的高表達(dá)可能也與原癌基因ras發(fā)展結(jié)合而促進(jìn)轉(zhuǎn)移。

(7) 邊界細(xì)胞的遷移:在果蠅中模擬腫瘤細(xì)胞遷移

轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志性特征是運(yùn)動(dòng)能力的增加。一個(gè)研究細(xì)胞遷徙行為的成熟果蠅模型是卵室邊界細(xì)胞模型。發(fā)育中卵室的關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生事件是一群上皮細(xì)胞進(jìn)行特征性的遷移，這種細(xì)胞叫做邊界細(xì)胞。在發(fā)育過(guò)程的特定點(diǎn)，一種叫做極細(xì)胞的特殊卵泡細(xì)胞，從前上皮毛囊細(xì)胞招募4～8個(gè)細(xì)胞形成一個(gè)邊界細(xì)胞群，侵入營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞復(fù)合體并遷移到前卵母細(xì)胞［34，35］。應(yīng)用基因篩選發(fā)現(xiàn)了控制這一調(diào)節(jié)過(guò)程的分子，并已鑒別出很多需要邊界細(xì)胞遷移的通路，包括PDGF/VEGF、EGF、JAK/STAT、Notch和JNK信號(hào)通路［34］。一個(gè)蛋白即Slbo，被發(fā)現(xiàn)是邊界細(xì)胞遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它是一個(gè)與C/EBP同源的基本區(qū)域/亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子［36］。邊界細(xì)胞全基因芯片分析是基因方法的補(bǔ)充，并證明了控制遷移行為的復(fù)雜性［37，38］。分析遷移基因的兩種芯片，鑒定出幾百個(gè)基因(300～400)，與卵泡中非遷移細(xì)胞相比，這些基因在遷移細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。來(lái)源于slbo突變體的邊界細(xì)胞有大約150個(gè)基因，與野生型邊界細(xì)胞相比其表達(dá)水平較低。在遷移細(xì)胞的這些基因中，大約富含100個(gè)重疊基因。對(duì)遷移重要的基因中富有細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)因子及分泌與內(nèi)吞途徑中的因子。

圖2-6 具有表達(dá)GFP的mosaic克隆(上圖)和從第三齡幼蟲分離cephalic復(fù)合體的果蠅中腫瘤進(jìn)展的模型(下圖)

注: 在所有圖中，上方為頂部，口鉤(A中的箭頭)在頂部，腹神經(jīng)索(A中的箭頭)指向下方。轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致幼蟲期延長(zhǎng)，最后細(xì)胞侵入VNC，以巨型幼蟲的狀態(tài)死亡(E中的箭頭)［32］。

邊緣細(xì)胞遷移模型用于研究在遷移細(xì)胞中Awd的功能，Awd是果蠅的同源轉(zhuǎn)移抑制基因nm23?？茖W(xué)家在20多年前就確認(rèn)了，nm23在高轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中作為c DNA被下調(diào)［39，40］，因而當(dāng)其在轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中表達(dá)時(shí)可以抑制轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性［39］。然而細(xì)胞功能例如核酸二磷酸激酶［41］和組胺素依賴的蛋白激酶［42］的活性已分配給nm23。nm23在細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面的功能一直是被研究的對(duì)象［41］。雖然在邊界細(xì)胞遷移開(kāi)始前Awd以高水平表達(dá)，但從上皮細(xì)胞分離前其表達(dá)量明顯下降，且在邊界細(xì)胞遷移時(shí)保持低水平［35］。Awd的重新表達(dá)，特別是在邊界細(xì)胞中的重新表達(dá)，阻礙了邊界細(xì)胞遷移(但沒(méi)有邊界細(xì)胞群的形成)，同時(shí)緩解了組成性激活Pvr的遷移抑制表型。Awd的活性使Pvr降低到控制水平而修復(fù)遷移缺陷。同時(shí)發(fā)現(xiàn)， Awd也是表面受體Domelss的負(fù)調(diào)節(jié)因子，而這需要STAT的核移位。實(shí)驗(yàn)研究Awd和Domeless或Pvt的關(guān)系得出， Awd通過(guò)干擾dynamin依賴性內(nèi)吞作用，控制細(xì)胞遷移重要表面受體的表達(dá)，這通常需要精確的時(shí)間和空間遷移控制。nm23可能在通過(guò)控制很多細(xì)胞表面的內(nèi)吞受體而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞活性方面發(fā)揮相似的作用。支持這一假說(shuō)的是，發(fā)現(xiàn)溶血磷脂酸受體EDG2在nm23-H1突變的乳腺癌轉(zhuǎn)移細(xì)胞中高表達(dá)。

(8) 果蠅瘤形成的腫瘤生物學(xué)

從果蠅腫瘤形成的腫瘤模型中得出的結(jié)論與在哺乳動(dòng)物腫瘤的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和功能的許多關(guān)鍵概念是一致的。許多哺乳動(dòng)物腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子也在果蠅腫瘤中發(fā)揮了作用，確認(rèn)了果蠅作為腫瘤模型可以提供人類腫瘤生物學(xué)的見(jiàn)解，可能包括人類轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療干預(yù)。果蠅腫瘤的實(shí)驗(yàn)證明這些細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)活動(dòng)過(guò)程，不只是簡(jiǎn)單的細(xì)胞從一個(gè)區(qū)域被動(dòng)移動(dòng)到另外一個(gè)區(qū)域停靠的運(yùn)動(dòng)。此外，在人類轉(zhuǎn)移性細(xì)胞中，細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為與特定蛋白的表達(dá)有關(guān)，否則會(huì)阻礙轉(zhuǎn)移。例如，果蠅Rasv12/scrib-/-腫瘤能夠從原位遷移到發(fā)育中的眼并入侵腹神經(jīng)節(jié)［32］。共聚焦顯微鏡顯示這些入侵細(xì)胞的前緣表達(dá)高水平F肌動(dòng)蛋白，這在主動(dòng)遷移細(xì)胞中是很常見(jiàn)的。此外，這些細(xì)胞定位在腹神經(jīng)節(jié)內(nèi)，說(shuō)明侵襲確實(shí)發(fā)生了。檢驗(yàn)Rasv12/scrib-/-腫瘤基膜的完整性實(shí)驗(yàn)表明，突變體眼磨片周圍基膜的很多位置被破壞，表明基膜被突變細(xì)胞降解。進(jìn)一步的研究證明在果蠅腫瘤轉(zhuǎn)移之前需要基膜的重塑。一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，果蠅基質(zhì)金屬蛋白酶在Rasv12/scrib-/-腫瘤中上調(diào)，并且可促進(jìn)這些細(xì)胞的侵襲行為［43］。部分抑制侵襲表型在mmp-1突變體中由Rasv12/scrib-/-克隆獲得。組織抑制金屬蛋白酶(TIMP)和另外一種回復(fù)引導(dǎo)半胱氨酸豐富及含kazal基因的蛋白酶抑制劑(RECK)的表達(dá)，并可完全阻礙侵襲［43］。另一項(xiàng)［44］利用果蠅卵巢管侵襲模型研究表明，MMP-1可促進(jìn)lgl的轉(zhuǎn)移，但對(duì)brat腫瘤無(wú)影響。MMP-1在lgl腫瘤中的表達(dá)量上調(diào);除去MMP-1，則可降低lgl腫瘤細(xì)胞卵巢管微轉(zhuǎn)移的概率。突變腦組織移植入brat(但不是lgl)的宿主，MMP-1在宿主卵巢中上調(diào)。雖然MMP-1表達(dá)的調(diào)控不同，但依賴于原發(fā)瘤的突變，MMP-1的表達(dá)成為卵巢管侵襲所需要的重要組分。在lgl和brat腫瘤中，TIMP的表達(dá)可使轉(zhuǎn)移概率降低。比較在lgl和brat腫瘤中MMP-1表達(dá)調(diào)控的差異，為進(jìn)一步探索發(fā)生在特定腫瘤抑制基因突變體下游的分子事件提供機(jī)會(huì)。

2.2.2 斑馬魚腫瘤模型

利用斑馬魚(zebrafish)來(lái)模擬腫瘤是一個(gè)越來(lái)越普及的方法，并預(yù)計(jì)其將在3個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮效用。首先，這種模型的遺傳篩選能力可以幫助鑒別對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程起作用的遺傳修飾。第二，斑馬魚的熒光成像性能特別有助于實(shí)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展和微環(huán)境相互作用的可視化。第三，斑馬魚藥理檢測(cè)依從性提供了篩查腫瘤化學(xué)修飾的平臺(tái)。在斑馬魚中應(yīng)用遺傳詢問(wèn)的主要方法和現(xiàn)存的腫瘤模型例子將會(huì)在這個(gè)章節(jié)中簡(jiǎn)要討論。我們已經(jīng)介紹了關(guān)于如何開(kāi)發(fā)應(yīng)用熒光成像技術(shù)更有效地監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程的情況，包括腫瘤細(xì)胞播散及腫瘤與脈管系統(tǒng)的相互作用，以及有關(guān)應(yīng)用斑馬魚研究腫瘤轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)和需要發(fā)展的領(lǐng)域。

(1) 斑馬魚基因?qū)W

斑馬魚很容易進(jìn)行基因操作［45、46］。另外一些使斑馬魚成為有吸引力模型系統(tǒng)的因素有體外授精、高繁殖力、快速生長(zhǎng)和高放養(yǎng)密度。斑馬魚的胚胎和幼蟲是透明的，這對(duì)于直接評(píng)估和挑選發(fā)育明顯的表型有很大幫助。此外，斑馬魚存在相當(dāng)可觀的基因組資源，包括斑馬魚完整的基因組序列，這可以很好地幫助鑒定突變(見(jiàn)http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/guide/zebrafish)?；瘜W(xué)誘變和向前表型驅(qū)動(dòng)篩選或逆轉(zhuǎn)等候選基因方法，可以使魚的突變品系具有實(shí)用性，其中一些與哺乳動(dòng)物腫瘤生物學(xué)有著明顯的相關(guān)性。

使用反轉(zhuǎn)錄病毒整合的方法使隨機(jī)誘變成功地應(yīng)用于斑馬魚中。正向基因篩查已應(yīng)用到可篩查表型如增殖缺陷或胚胎致死性中，隨后可以觀察特定腫瘤發(fā)生率提高的成年表型。用這種正向表型篩查出的多數(shù)基因與哺乳動(dòng)物的癌癥無(wú)相關(guān)性，如Myosin、Separase多個(gè)核糖體蛋白，它們與人類腫瘤的關(guān)聯(lián)還有待確定。

因?yàn)樵诎唏R魚中存在原始全基因組的重復(fù)現(xiàn)象， W-ethyl-N-亞硝基脲誘變后，可用反向篩選方法直接篩選已知或預(yù)期的腫瘤相關(guān)基因。因此在某些情況下，基因重復(fù)可能導(dǎo)致產(chǎn)生亞功能和新功能，就像已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的pten重復(fù)同源體ptena和ptenb［47］。采用反向基因方法已在人類腫瘤中證實(shí)的腫瘤相關(guān)基因的突變系，如tp53、ape、ptenb，以及顯示特定自發(fā)或致癌物誘發(fā)癌癥的高發(fā)率錯(cuò)配修復(fù)基因［47-49］。在這些品系中自發(fā)產(chǎn)生腫瘤的概率為3%，這些腫瘤發(fā)生于7～18個(gè)月。這些自發(fā)腫瘤類型往往與人類不同，例如神經(jīng)鞘瘤。另一方面也闡述了肝臟和腸道腫瘤及肉瘤。

在斑馬魚中應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，模擬了幾種人類常見(jiàn)腫瘤類型［45，50-52］。轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以通過(guò)將結(jié)構(gòu)注射入受精卵中完成，產(chǎn)生概率＞5%的生殖系傳遞。斑馬魚轉(zhuǎn)基因腫瘤模型是根據(jù)我們已所熟悉的原理建立的，即組織特異性啟動(dòng)子操縱癌基因表達(dá)。通常，熒光標(biāo)記與癌基因共表達(dá)，使表達(dá)癌基因的細(xì)胞直接可視化。雖然每個(gè)腫瘤模型都需要進(jìn)行分別的評(píng)估，但有證據(jù)表明，某些人類和斑馬魚的腫瘤類型在組織學(xué)和分子學(xué)上都有相似之處［53，54］。如今，模型已經(jīng)越來(lái)越成熟，利用Cre-loxP技術(shù)聯(lián)合條件性表達(dá)［55］在處理小鼠模型的基因組中被廣泛應(yīng)用。

已經(jīng)利用在淋巴細(xì)胞中高表達(dá)rag-2啟動(dòng)子，發(fā)展出幾種白血病模型［51，56］。另外，組織特異性可以由原癌基因決定，像白血病融合蛋白TEL-AML1，其表達(dá)自普遍存在的β-actin啟動(dòng)子，導(dǎo)致B超譜系白血病［57］。此外，在未分化的肌肉中rag-2驅(qū)使k RASG12D表達(dá)的情況下，構(gòu)建啟動(dòng)子的意外異常表達(dá)被用來(lái)開(kāi)發(fā)模型，產(chǎn)生橫紋肌肉瘤［54］。實(shí)體腫瘤模型已經(jīng)可產(chǎn)生橫紋肌肉瘤、黑色素瘤和神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤［54，58，59］。隨著越來(lái)越多的組織特異性啟動(dòng)子被研究，腫瘤組織學(xué)類型的范圍有望擴(kuò)大。腫瘤形成模型的外顯率是多變的，說(shuō)明其他基因活動(dòng)參與了腫瘤的形成［45，50］。與此一致的是，跨兩個(gè)轉(zhuǎn)基因模型或跨一個(gè)轉(zhuǎn)基因模型和一個(gè)突變腫瘤敏感系，可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生率的提高，以及提高腫瘤的侵襲性或縮短腫瘤潛伏期。

(2) 斑馬魚腫瘤的熒光成像

斑馬魚在一個(gè)完整的脊椎動(dòng)物系統(tǒng)體內(nèi)單細(xì)胞水平的熒光細(xì)胞成像能力非常明顯［52］。如前所述，斑馬魚的胚胎是透明的，而成年斑馬魚則不是。盡管正常的皮膚和皮下組織能使空間分辨率受限，然而成年斑馬魚足夠小，允許活體內(nèi)熒光器官或腫瘤的可視化。透明成年斑馬魚(roy-/-、nacre-/-)最近的研究進(jìn)展，即所謂casper變異，可提高觀察的敏感性，解決并量化熒光細(xì)胞［60］。

熒光成像被用于轉(zhuǎn)基因模型和移植的研究中。在轉(zhuǎn)基因模型中，原癌基因表達(dá)的熒光標(biāo)記使正在發(fā)展的腫瘤可視化，包括發(fā)病時(shí)間、地點(diǎn)和增長(zhǎng)率。重要的是，熒光標(biāo)記腫瘤細(xì)胞也可提供一種分析腫瘤對(duì)治療反應(yīng)的手段［61］。熒光也可用于跟蹤控制Cre-lox P介導(dǎo)的重組事件，其可識(shí)別異源混合物中的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。由明顯分化依賴性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光標(biāo)記已被用于鑒定腫瘤的細(xì)胞分化［54］。在腫瘤微環(huán)境中熒光標(biāo)記的表達(dá)如血管，可制作宿主-腫瘤相互作用圖像［62］。

熒光標(biāo)記細(xì)胞的移植實(shí)驗(yàn)已被用于觀察定位和與宿主脈管系統(tǒng)的相互作用。成年或未成年的宿主魚一般在移植前被免疫抑制。細(xì)胞可以通過(guò)心臟路徑進(jìn)入，或進(jìn)行細(xì)胞群腹腔注射。雖然來(lái)源于斑馬魚腫瘤的細(xì)胞系還沒(méi)有建立，但有可能以原發(fā)腫瘤單細(xì)胞懸液移植，并觀察遠(yuǎn)離移植腫瘤位置的一小群細(xì)胞的播散［60］。另外，人類腫瘤細(xì)胞系的異種移植已經(jīng)完成。在一項(xiàng)研究中，多色高分辨率共聚焦顯微鏡使科學(xué)家觀察到了基因操作的人類腫瘤細(xì)胞和斑馬魚脈管系統(tǒng)間的動(dòng)態(tài)交互，并可血管重塑［63］。令人驚訝的是，不論內(nèi)在發(fā)展還是移植，熒光標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞與熒光宿主器官結(jié)合，提供了在適當(dāng)機(jī)體環(huán)境中實(shí)時(shí)無(wú)創(chuàng)觀察腫瘤細(xì)胞的手段。

(3) 斑馬魚作為轉(zhuǎn)移的遺傳模型

對(duì)于未來(lái)研究的一個(gè)令人興奮的可能性是，加深對(duì)斑馬魚成瘤模型的研究，即研究轉(zhuǎn)移機(jī)制(圖2-7顯示從斑馬魚移植位點(diǎn)轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞)。斑馬魚系統(tǒng)研究潛在轉(zhuǎn)移的分子事件的兩個(gè)優(yōu)勢(shì)是:異常順從性和相對(duì)簡(jiǎn)單以及高效的體內(nèi)藥物分析。斑馬魚可以直接從水里吸收小分子化合物，這種有機(jī)體特別適合在活的脊椎動(dòng)物中開(kāi)展藥物篩選。用斑馬魚開(kāi)展高、中通量篩選來(lái)說(shuō)明轉(zhuǎn)移機(jī)制的作用還需要進(jìn)一步確定。

圖2-7 移植黑色素瘤細(xì)胞在casper突變體斑馬魚中從移植位點(diǎn)遠(yuǎn)端遷移。單一遷移的黑色素瘤細(xì)胞(右圖標(biāo)記)從移植位點(diǎn)遷移到背部皮膚［59］

不管是轉(zhuǎn)移相關(guān)表型的遺傳篩選還是藥理篩選，都依賴于高效率生成和容易取得的系統(tǒng)，例如轉(zhuǎn)基因熒光腫瘤模型。由于可以自動(dòng)和定量產(chǎn)生體內(nèi)腫瘤細(xì)胞特征的清晰視覺(jué)效果圖，將有利于這一重要領(lǐng)域研究的發(fā)展。有關(guān)發(fā)現(xiàn)新基因或新通路的潛在意義的一個(gè)可能方案是對(duì)腫瘤細(xì)胞播散的進(jìn)展或抑制的篩查。然而，一個(gè)關(guān)鍵的問(wèn)題涉及各種轉(zhuǎn)基因模型腫瘤發(fā)展的自然史，如在遠(yuǎn)端存在腫瘤克隆，是否來(lái)自于血管擴(kuò)散或淋巴擴(kuò)散;如果沒(méi)有血管內(nèi)滲，在組織中具侵襲運(yùn)動(dòng)性的腫瘤細(xì)胞也是有可能的。在得知這種模型研究哺乳動(dòng)物癌癥進(jìn)展相關(guān)機(jī)制的實(shí)用范圍之前，還是需要斑馬魚腫瘤模型其他基本特征研究的協(xié)助。

另外，篩選基因或化學(xué)修飾基因可以不考慮在斑馬魚中的進(jìn)展表型，例如已知的促進(jìn)哺乳動(dòng)物癌癥發(fā)展和轉(zhuǎn)移的基因ras。在這種情況下，篩選可以分析例如腫瘤細(xì)胞生存或新陳代謝的效果。斑馬魚腫瘤模型的發(fā)展顯示應(yīng)用這些系統(tǒng)研究癌癥發(fā)展的潛能，并可能確定用于轉(zhuǎn)移治療相關(guān)的先導(dǎo)藥物。雖然有許多方面還沒(méi)有弄清楚和開(kāi)發(fā)，但斑馬魚模型已經(jīng)開(kāi)始并有可能繼續(xù)在腫瘤生物學(xué)研究中占據(jù)獨(dú)特和重要的地位。

2.2.3 結(jié)論

當(dāng)各種生物和動(dòng)物模型被用于研究人類腫瘤和轉(zhuǎn)移時(shí)，必須考慮模型系統(tǒng)和人類生物學(xué)之間生理特性的顯著區(qū)別。然而，本質(zhì)上保守的信號(hào)通路及其功能效應(yīng)使基因順從模型作為臨床標(biāo)本、哺乳動(dòng)物模型和細(xì)胞系的有價(jià)值補(bǔ)充。盡管與人類相比，果蠅和斑馬魚的腫瘤有所不同，但是這些模型提供了獨(dú)特的正向和逆向遺傳篩選的機(jī)會(huì)，可以篩選影響腫瘤形成和(或)轉(zhuǎn)移的基因，并且完成了在其他模型中很難或不可能的操作。在無(wú)偏差遺傳篩選中發(fā)現(xiàn)，相同信號(hào)通路或交叉調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路的蛋白質(zhì)間存在密切關(guān)系。最近，成像技術(shù)的進(jìn)步，使成熟的遺傳技術(shù)與體內(nèi)癌癥和轉(zhuǎn)移相關(guān)生理過(guò)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成為可能，這些有用的模型系統(tǒng)，在未來(lái)作為強(qiáng)大的研究手段將會(huì)產(chǎn)生更多的創(chuàng)新。

(喬鵬譯，欽倫秀審校)

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