一、概述

皮膚經(jīng)低溫儲(chǔ)存并經(jīng)復(fù)溫后，除非是完全壞死失活的皮膚，輕擦表皮就可和真皮分離，其他從外表上看，色澤、柔軟度、彈性與新鮮皮差別不大。所以必須采用一些方法來監(jiān)測(cè)其質(zhì)量和活力，作為能否移植于病人的依據(jù)，也是進(jìn)行皮膚儲(chǔ)存研究工作的必要方法和手段。皮膚的生發(fā)層細(xì)胞及附件的細(xì)胞內(nèi)存在許多酶，如琥珀酸脫氫酶（SDH）、乳酸脫氫酶（LDH）、酸性脫氫酶、Tween-60酯酶、細(xì)胞色素氧化酶、單氨氧化酶（MAO）、 吲哚酚醋酯酶（IAE）、磷酸化酶等。目前檢測(cè)皮膚活力的方法很多，如用組織化學(xué)的方法對(duì)各種酶進(jìn)行定性或定量試驗(yàn)，采用微型呼吸計(jì)測(cè)定細(xì)胞的氧耗，同位素標(biāo)記法測(cè)定蛋白質(zhì)或DNA的合成，光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察組織形態(tài)與細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，以及復(fù)原移植或細(xì)胞培養(yǎng)觀察皮片成活率及細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)等。

二、琥珀酸脫氫酶測(cè)定法

琥珀酸脫氫酶（SDH）大部分存在于細(xì)胞的線粒體內(nèi)，測(cè)定原理是SDH使琥珀酸脫去兩個(gè)H形成延胡索酸，而這兩個(gè)H作用于四氮唑藍(lán)（blue tetrazolium，BT）還原形成藍(lán)色顆粒雙甲臢（diformazan）。結(jié)果顯示有高度的SDH活性者呈藍(lán)色，活性較低者呈紅色，無活性者不著色。該方法快速簡(jiǎn)便，可作為皮膚保存方法選擇及臨床使用前活力判斷的一種手段，但是其準(zhǔn)確性不如定量試驗(yàn)。

Montagna（1962，1995）和Fromisano（1954）均指出，表皮基底細(xì)胞層SDH活性最強(qiáng)，胞質(zhì)內(nèi)充滿表達(dá)酶活性的顆粒，其分布與線粒體一致，此顆粒在棘細(xì)胞層逐漸減少，在顆粒層很少。毛囊、汗腺、皮脂腺及其導(dǎo)管的SDH活性均很強(qiáng)，主要存在于基底細(xì)胞，而真皮的SDH活性很低。因此，皮膚SDH活性與其代謝和細(xì)胞增殖有關(guān)。琥珀酸脫氫酶主要功能是使琥珀酸脫氫生成延胡索酸，是能量代謝三羧酸循環(huán)的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。此酶含量的多少可以反映出細(xì)胞和組織的活力。測(cè)定的原理為：

測(cè)定的步驟為把皮片秤重，剪成小塊，放入特制的桑氏管內(nèi)，抽出空氣，裝入氮?dú)?。然后將桑氏管上端的試液（琥珀?紅四氮唑）倒入，在37℃水浴中孵化1h，取出皮片。SDH使琥珀酸脫去的兩個(gè)H原子，使紅四氮唑（三苯四氮唑，2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC）形成紅色沉淀，即紅色甲氮唑（formazan）。經(jīng)乙二醇乙醚浸出4h后，將浸出液用波長(zhǎng)490μm的分光光度計(jì)比色，讀出光密度數(shù)（optimal density，OD），按OD/mg皮片重量計(jì)算出測(cè)定值及百分率，即可得出代表皮膚活力的數(shù)值。

新鮮皮膚SDH活力（X1）=OD/mg皮片重量

保存后皮膚SDH活力（X2）=OD/mg皮片重量

保存后皮膚SDH活性的百分率（%）=X2/X1×100

三、臺(tái)盼藍(lán)染色法

臺(tái)盼藍(lán)（trypan blue，TB）是一種細(xì)胞活體組織染色劑，又稱錐藍(lán)染色。具體方法是將要測(cè)定的皮片剪成小塊，用胰酶消化成上皮細(xì)胞混懸液。吸入0.1ml加入0.1%臺(tái)盼藍(lán)液0.4ml混合后，在顯微鏡下觀察100個(gè)上皮細(xì)胞。染有藍(lán)色的為死細(xì)胞，不著色的為活細(xì)胞。數(shù)出活細(xì)胞數(shù)就可算出百分率。此方操作簡(jiǎn)便，不需特殊設(shè)備，1h就可得結(jié)果，但有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性。

四、測(cè)定放射同位素標(biāo)記摻入檢測(cè)法

較常用的放射同位素標(biāo)記物有3H-核酸、14C-亮氨酸蛋白、14C-葡萄糖、14C-甘氨酸蛋白和35S-硫酸鈉黏多糖等。14C-亮氨酸摻入法是將以放射性同位素14C標(biāo)記的亮氨酸作為示蹤物，利用在表皮細(xì)胞蛋白合成代謝中，亮氨酸參與表皮片基底層細(xì)胞代謝增殖的狀況，當(dāng)與摻入的14C一起參與皮片蛋白質(zhì)合成代謝時(shí)，測(cè)定其示蹤的放射性含量，再計(jì)算出14C-亮氨酸的摻入量，能較好地了解到皮片細(xì)胞代謝情況及反映出皮膚活力的高低。

3H-尿嘧啶核苷（3H-UR）摻入法是將標(biāo)記的3H-UR摻入后作為示蹤劑，然后測(cè)定其表皮細(xì)胞內(nèi)RNA的量，并觀察蛋白質(zhì)RNA合成代謝的狀況，還可將3H-胸腺嘧啶核苷摻入以測(cè)定同位素與細(xì)胞內(nèi)DNA的摻入率，當(dāng)上皮細(xì)胞的活力減退時(shí)，則同位素的摻入率就降低。

上述同位素?fù)饺氲木唧w測(cè)定方法為：將要測(cè)定的皮膚標(biāo)本用胰酶消化成上皮細(xì)胞混懸液，然后加入相應(yīng)的同位素并蛋白摻入，或加入3H及相應(yīng)的核苷以測(cè)定同位素與細(xì)胞內(nèi)的RNA或DNA的摻入率，在37℃孵化一定的時(shí)間，再用三氯醋酸中止其反應(yīng)，洗脫未與蛋白質(zhì)結(jié)合的同位素后，將標(biāo)本置于液閃的記錄儀內(nèi)，結(jié)合的放射性以dpm/mg組織表示，可以計(jì)算出該皮膚的活力高低。放射同位素標(biāo)記摻入是一種較準(zhǔn)確的皮膚活力測(cè)定方法，但因其同位素具有放射性，儲(chǔ)存和運(yùn)輸不便，操作時(shí)易污染環(huán)境，需要專業(yè)人員操作以及專門的防護(hù)設(shè)備，且應(yīng)用設(shè)備也較昂貴，不便于在基層醫(yī)院推廣使用。

五、皮膚氧耗量測(cè)定法

這是一種新型的電化學(xué)氣敏分析法，其主要原理是有活力的組織均有代謝，所以要耗氧。在恒溫的營(yíng)養(yǎng)液內(nèi)，與有活力的皮膚接觸的微電極（鉑、銀電極）表面氧分壓下降，可以通過放大器測(cè)出氧分壓下降的程度，從而可以推算出皮膚的活力，操作過程可在1h內(nèi)完成。測(cè)定值用kPa/60s表示，其測(cè)量值代表皮片的活力，測(cè)量值高者，皮片活力高，反之則皮片活力低。

六、皮塊培養(yǎng)法

利用組織塊培養(yǎng)的方法，對(duì)皮膚塊進(jìn)行培養(yǎng)觀察，測(cè)量其在培養(yǎng)液中皮片向外生長(zhǎng)的速度及面積，具體的方法是把要測(cè)定的皮片用銳刀切成小塊，放入24孔培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入組織培養(yǎng)液，在37℃的二氧化碳孵箱內(nèi)培養(yǎng)。7d后如皮塊周圍有上皮細(xì)胞向外擴(kuò)展生長(zhǎng)，則證實(shí)測(cè)定的皮塊具有活力，并根據(jù)皮塊擴(kuò)展生長(zhǎng)的周徑及時(shí)間，利用顯微鏡圖像分析系統(tǒng)測(cè)量出其皮片生長(zhǎng)的面積及速率。該方法需要專門的細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)與設(shè)備，培養(yǎng)時(shí)間周期長(zhǎng)，適用于實(shí)驗(yàn)觀察、研究之用。

七、皮片生物移植法

此法是臨床中最直接可靠的皮片活力鑒定方法，無論是何種皮片及儲(chǔ)存的方法，最終結(jié)果是以皮片能否在生物體內(nèi)移植存活為鑒定標(biāo)準(zhǔn)。因此，這也是筆者當(dāng)前燒傷創(chuàng)面治療及皮片動(dòng)物移植實(shí)驗(yàn)中最具體的生物學(xué)方法。它把要測(cè)定的皮片剪成小塊移植于小鼠或大鼠的背部，5～7d后觀察皮片成活的情況，如果皮片柔軟，色澤轉(zhuǎn)紅，則說明具有良好的活力。也可用同樣方法將皮膚移植于病人的供皮區(qū)，如果移植后4～5d，皮片轉(zhuǎn)紅，無水皰形成，則說明被測(cè)定的皮片具有100%的活力。但此方法不適合于臨床救治大面積和深度燒傷病人切（削）痂覆蓋創(chuàng)面。

八、四氮唑鹽WST-1法

WST-1是體外合成的一種新型的細(xì)胞活化劑，其化學(xué)名稱為4-[3-（4-碘苯基）-2-（4-硝苯基）-2-H-5四氮唑]-1，3-苯碘酸鈉。它的作用原理是：利用體內(nèi)具有活力的組織或細(xì)胞中的RS（線粒體琥珀酸四氮唑反應(yīng)體系），作用在亞細(xì)胞的呼吸鏈反應(yīng)中的NADH（還原型輔酶Ⅰ）、NAD+（輔酶Ⅰ）脫氫（H）反應(yīng)與體內(nèi)具有活力的細(xì)胞組織中的呼吸鏈EC（電子偶聯(lián)反應(yīng)體系）結(jié)合，將H結(jié)合到WST-1的甲氮唑苯環(huán)上，打開其四氮唑苯環(huán)而成顯色反應(yīng)，其反應(yīng)底物變?yōu)榧椎?。因此，只有體內(nèi)測(cè)定的組織細(xì)胞具有活力，其變化的高低必然反映出上述體內(nèi)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的加H反應(yīng)過程的多少，因而呈現(xiàn)出的甲氮唑成色反應(yīng)也越重?？梢愿鶕?jù)這種成色反應(yīng)來間接反映某一組織細(xì)胞活力的高低。該法簡(jiǎn)單易行、靈敏迅速，只需3～4h就可完成整個(gè)實(shí)驗(yàn)。具體方法為：取備用皮片，室溫下用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3遍，各實(shí)驗(yàn)組均檢測(cè)8塊直徑為10mm的圓形小皮片。將小皮片分別置入96孔無菌塑料培養(yǎng)皿，每孔加入PBS 200μl，再加入WST-1 20μl。設(shè)立等劑量空白（未加皮片）對(duì)照組。置37℃的CO2孵箱內(nèi)3h，棄去皮片，培養(yǎng)液置入雙波長(zhǎng)酶聯(lián)儀，在450/690nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。實(shí)驗(yàn)組OD值減去對(duì)照組OD值，結(jié)果為皮片實(shí)測(cè)的OD值。

WST-1為水溶性細(xì)胞組織的活化劑，它較MTT、XTT和MTS的新型四氮唑鹽的細(xì)胞活化劑更敏感、更穩(wěn)定、無放射性、反應(yīng)時(shí)間更短，不用漂洗及具有操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，且價(jià)格低廉，已被國(guó)內(nèi)大中型醫(yī)院燒傷科皮庫(kù)或有關(guān)的研究單位所采用。

九、SYTO/EB雙重染色法

SYTO/EB活力測(cè)定方法為先將皮塊切片，撈片后PBS洗3次，每次3min，滴加SYTO 13工作液50μl，37℃避光孵育20min，PBS洗3次，每次3min，滴加50μl EB（1μg/ml），在冰浴中避光30min。PBS洗3次，每次3min。然后在488/520nm波長(zhǎng)光譜激發(fā)，Olympus熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)。熒光顯微鏡下活細(xì)胞發(fā)亮綠色熒光，死細(xì)胞發(fā)紅色熒光，通過辨識(shí)兩種顏色的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后計(jì)算出活力的百分比。

SYTO/EB活力測(cè)定和WST-1活力測(cè)定方法的比較無明顯差異。

SYTOTM核酸染色劑是一組新的穿透性核酸染色劑，該染色劑可穿透活細(xì)胞膜，與核酸DNA/RNA結(jié)合，在一定的激發(fā)和發(fā)射光譜下發(fā)出熒光。該系列各種染色劑之間在細(xì)胞穿透性、與核酸結(jié)合后熒光的增強(qiáng)度、激發(fā)/發(fā)射光譜和DNA/RNA結(jié)合活性特異性等方面有所差異，因此可以對(duì)多種細(xì)胞和細(xì)菌進(jìn)行染色。研究SYTO與其他染色劑相比有許多特性：①用乙醇可將其從核酸上去除，但不能用氯仿和丁醇將其去除，這一點(diǎn)與EB和其他摻入性染色劑相反；②它與核酸的結(jié)合不受非離子去垢劑的影響；③因?yàn)樗慕Y(jié)合方式與Hoechst或DAPI不同，因而不能被BrdU淬滅；④該系列染色劑均為陽(yáng)性離子，因此與帶負(fù)電荷的離子物質(zhì)如核酸可以發(fā)揮最大結(jié)合活性。

而另外一種常用的染色劑EB也可以與核酸結(jié)合，但由于其分子量較大不能自由穿過細(xì)胞膜，只有在細(xì)胞死亡或細(xì)胞損傷細(xì)胞膜出現(xiàn)裂隙時(shí)才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA結(jié)合發(fā)出紅色熒光。根據(jù)兩種染色劑的特性，同時(shí)對(duì)皮膚組織進(jìn)行雙重染色，然后在一定的激發(fā)/發(fā)射光譜的激發(fā)下可以同時(shí)顯示皮膚組織活細(xì)胞和失去活力細(xì)胞的分布。由于在熒光顯微鏡下兩種染色劑所發(fā)出的熒光顏色不同，可以對(duì)兩種不同顏色染色的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算后即可得到皮膚組織的活力。

兩種方法在機(jī)制上是有根本區(qū)別的，其中WST-1是一種間接測(cè)定法，以細(xì)胞內(nèi)線粒體的呼吸功能來反映組織活力，代表了組織內(nèi)各種細(xì)胞成分的活力總值。而SYTO／EB法可以從形態(tài)上直接觀察到組織不同部位各種細(xì)胞的活力狀態(tài)，因此能夠?qū)λ枰课坏募?xì)胞進(jìn)行活力的計(jì)算，在實(shí)際工作中可應(yīng)用于特殊的實(shí)例。兩種方法測(cè)定的活力值非常接近。SYTO/EB染色測(cè)定法整個(gè)過程只需1h左右，較WST-1法操作時(shí)間更短，而且結(jié)果敏感性與WST-1測(cè)定結(jié)果相近。另外該法的操作更為簡(jiǎn)便，只需一臺(tái)熒光顯微鏡即可完成活力的檢測(cè)，不失為一種敏感的、快速的皮膚活力檢測(cè)方法。