按性質(zhì)分類,葡萄糖的測定方法主要有4大類,包括無機化學法(氧化還原法,亦稱Folin-Wu法)、有機化學法(縮合法)、生物化學法(酶法)和儀器分析技術(shù)(如固相酶技術(shù)、生物傳感器技術(shù)和核素稀釋-質(zhì)譜分析技術(shù)等)。其中無機化學法因特異性差,受血中其他還原糖的干擾,現(xiàn)已淘汰。有機化學法主要為鄰甲苯胺法,因干擾因素多,試劑有腐蝕性和致癌性已很少使用。下面主要介紹酶法。

血糖的酶法檢驗是利用酶的特異性催化作用建立起來的,目前主要有葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,GOD)法、己糖激酶(hexokinase,HK)法和葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH)法。其特點是靈敏度高,準確度和精密度好,反應條件溫和,操作簡單方便,適于自動化分析儀。

(一)葡萄糖氧化酶法

葡萄糖氧化酶法是血糖測定的推薦常規(guī)方法,也是目前國內(nèi)各類醫(yī)院使用最多的血糖測定方法。

【原理】 本法分為質(zhì)譜分析法(速率法)和比色分析法兩類。初始反應均為葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶催化,氧化為葡萄糖酸(D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯),同時消耗溶液中的氧,并釋放出過氧化氫。

【試劑】

1.0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(p H 7.0) 稱取無水磷酸氫二鈉8.67g、無水磷酸二氫鉀5.3g,溶于800ml蒸餾水中,用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)節(jié)p H至7.0,蒸餾水定容至1L。

2.酶試劑 稱取葡萄糖氧化酶1200U,過氧化物酶1200U,4-氨基安替比林10mg,疊氮鈉100mg,溶于上述磷酸鹽緩沖液約80ml中,用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)p H至7.0,用磷酸鹽緩沖液定容至100ml,置4℃保存,可穩(wěn)定3個月。

3.酚溶液 稱取重蒸餾酚100mg溶于100ml蒸餾水中,貯存于棕色瓶。

4.酶酚混合試劑 酶試劑與酚溶液等量混合,貯存于棕色瓶中,4℃可保存1個月。

5.12mmol/L苯甲酸溶液 稱取苯甲酸1.4g溶于約800ml蒸餾水中,加熱溶解,冷卻后,加蒸餾水定容至1L。

6.100mmol/L葡萄糖標準貯存液 準確稱取無水葡萄糖1.802g,用12mmol/L苯甲酸溶液溶解并定容至100ml。2h以后方可使用。

7.5mmol/L葡萄糖標準應用液 吸取葡萄糖標準貯存液5.0ml置于100ml容量瓶中,用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度,混勻。

【操作】

1.自動分析 自動生化分析儀參數(shù)設置參照有關(guān)試劑盒的說明書。按儀器說明書的要求進行測定。

2.手工分析 按表5-3操作。

質(zhì)譜分析法是用氧電極監(jiān)測溶液中氧的消耗量,后者與血液中葡萄糖的濃度成正比。

比色分析法是將GOD與過氧化物酶(peroxidase,POD)偶聯(lián),在POD的作用下,將色原性氧受體4-氨基安替比林和酚縮合成紅色醌類化合物,即Trinder反應。該紅色醌類化合物的生成量在一定范圍內(nèi)與葡萄糖含量呈線性關(guān)系,與標準管比較,可計算出血糖濃度。

表5-3　GOD-POD法測定血糖操作步驟

【參考區(qū)間】 見表5-2。

【質(zhì)量保證】

1.葡萄糖氧化酶對β-D葡萄糖高度特異。溶液中的葡萄糖約36%為α型,64%為β型。葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的變旋反應,新配制的葡萄糖標準液主要是α型,故須放置2h以上(最好過夜),待變旋平衡后方可應用。某些商品葡萄糖氧化酶試劑盒含有葡萄糖變旋酶,可加速這一反應,但在終點法中,延長孵育時間可達到完成自發(fā)變旋過程。

2.尿液中尿酸等干擾物質(zhì)濃度過高,可干擾過氧化物酶反應,造成結(jié)果偏低,出現(xiàn)假陰性。故該法不能直接測定尿液葡萄糖含量,但可直接測定腦脊液葡萄糖含量。

3.因紅細胞的酵解將導致測定結(jié)果偏低,認為草酸鉀-氟化鈉的抗凝血漿較好。草酸鉀-氟化鈉抗凝劑的配制:取草酸鉀6g,氟化鈉4g,加水定容至100ml。吸取0.1ml于試管內(nèi),在80℃以下烤干使用。可使2~3ml血液在3~4d內(nèi)不凝固并抑制糖分解。

4.嚴重黃疸、溶血及乳糜樣血清應先制備無蛋白血濾液,然后再進行測定。

【應用評價】

1.用本法測定葡萄糖,從原理反應式可以看出,第一步反應葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸內(nèi)酯為特異性反應,而第二步特異性較差。誤差往往發(fā)生在反應的第二步。某些還原性物質(zhì)如尿酸、維生素C、膽紅素、谷胱甘肽等,可與色原性物質(zhì)競爭過氧化氫,從而消耗反應過程中產(chǎn)生的過氧化氫,產(chǎn)生競爭性抑制,使測定結(jié)果偏低,但添加了抗干擾成分的試劑盒可消除上述物質(zhì)的干擾。

2.本法線性范圍至少可達22.24mmol/L,回收率94%~105%,批內(nèi)CV為0.7%~ 2.0%。批間CV為2%左右,日間CV為2%~3%。本法與己糖激酶法的相關(guān)系數(shù)高,其精密度與準確度均能達到臨床要求,且操作簡便,適用于常規(guī)檢驗,是衛(wèi)生部臨床檢驗中心推薦的方法。

【臨床意義】

1.生理性高血糖 見于高糖飲食、情緒緊張等。

2.病理性高血糖

(1)糖尿病:病理性高血糖常見于胰島素絕對或相對不足的糖尿病。

(2)內(nèi)分泌疾病所致特殊類型糖尿病:如甲狀腺功能亢進、腎上腺皮質(zhì)功能亢進(庫欣病)

混勻,置37℃水浴保溫15min,放置冷卻至室溫,在505nm波長處,以空白管調(diào)零,分別測定標準管及測定管的吸光度值。

【計算】及髓質(zhì)功能亢進(嗜鉻細胞瘤)、垂體前葉功能亢進(巨人癥、肢端肥大癥)等,引起各種對抗胰島素的激素分泌過多而出現(xiàn)高血糖。

(3)應激性高血糖:如顱外傷、顱內(nèi)出血、腦膜炎等,因顱內(nèi)壓增高刺激血糖中樞導致血糖增高。

3.生理性低血糖 見于饑餓、劇烈運動等。

4.病理性低血糖

(1)胰島B細胞增生或胰島B細胞瘤等,使胰島素分泌過多。

(2)對抗胰島素的激素分泌不足,如垂體前葉功能減退、腎上腺皮質(zhì)或甲狀腺功能減退而使生長素、腎上腺皮質(zhì)激素、甲狀腺激素分泌減少。

(3)嚴重肝病患者,肝的糖異生作用降低或肝糖原儲備缺乏,肝不能有效地調(diào)節(jié)血糖。

(二)己糖激酶法

己糖激酶法是血糖測定的參考方法,特別適用于急診檢驗,但試劑較貴。

【原理】 葡萄糖與ATP經(jīng)己糖激酶催化,生成葡萄糖-6-磷酸與ADP。葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G-6-PD)的催化下脫氫,生成6-磷酸葡萄糖酸,同時使NADP+還原成NADPH和H+。NADPH的生成速度與葡萄糖濃度成正比,在340nm波長處監(jiān)測NADPH吸光度升高速率或采用終點法進行檢測,與標準管比較,可計算出血糖濃度。

【試劑】

1.酶混合試劑 己糖激酶測定葡萄糖,多用試劑盒,目前國外生產(chǎn)試劑盒的廠家很多,其配方大同小異。

酶混合試劑的組成成分與濃度如下

三乙醇胺鹽緩沖液(p H7.5) 50mmol/L

MgSO4 2mmol/L

ATP 2mmol/L

NADP+ 2mmol/L

HK ≥1500U/L

6-磷酸葡萄糖脫氫酶 2500U/L

按試劑盒說明書配制,置4℃保存。

2.100mmol/L葡萄糖標準貯存液 準確稱取無水葡萄糖1.802g,用12mmol/L苯甲酸溶液溶解并定容至100ml,放置2h后方可使用。

3.5mmol/L葡萄糖標準應用液 吸取葡萄糖標準貯存液5.0ml置100ml容量瓶中,用12mmol/L苯甲酸溶液稀釋至刻度,混勻。

【操作】

1.速率法 自動生化分析儀參數(shù)設置參照有關(guān)試劑盒的說明書。

2.終點法 按表5-4操作。

表5-4　己糖激酶法測定血糖操作步驟

各管充分混勻,于37℃水浴中準確放置10min,在340nm波長處,用5mm比色皿,以蒸餾水調(diào)零,立即分別讀取各管吸光度。

【計算】

1.速率法

2.終點法

【參考區(qū)間】 見表5-2。

【質(zhì)量保證】

1.HK為反應的關(guān)鍵工具酶,必須使用高純度產(chǎn)品,其比活性應>140U/mg酶蛋白(25℃)。HK的雜酶G-6-PD、谷胱甘肽還原酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶均應<0.01%HK活性單位,磷酸葡萄糖異構(gòu)酶應<0.02%HK活性單位。G-6-PD也是反應的關(guān)鍵工具酶,其雜酶磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶均應<0.01%G-6-PD活性單位,谷胱甘肽還原酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶均應<0.02%G-6-PD活性單位。

2.HK的最適p H 6.0~9.0,pI為4.5~4.8。Mg2+為HK的激活劑,EDTA為抑制劑。從酵母中獲得的G-6-PD,需NADP+作為輔酶,最適p H>8.5;如使用細菌來源的G-6-PD,則以NAD+作為輔酶,最適p H為7.8。

3.NAD+或NADP+的純度要求達98%以上。

4.對試劑的要求。試劑空白在保溫30min時吸光度<0.1,保溫6min與30min間吸光度變化<0.01;33.3mmol/L葡萄糖標準液保溫30min后的吸光度在1.6~1.8,保溫8min與30min吸光度之差<0.01。

5.實驗過程中,應保證加樣量的準確,并且應嚴格控制酶促反應條件,如反應溫度、時間和緩沖液的p H等。

6.如果用耐熱的葡糖激酶代替HK,既可提高專一性,又可提高穩(wěn)定性。

【應用評價】

1.己糖激酶法的準確度和精密度高,特異性高于葡萄糖氧化酶法,干擾少,適用于自動分析,是目前公認測定血糖的參考方法,特別適用于急診檢驗。

2.本法的線性范圍可達33.31mmol/L,最高達40.8mmol/L?；厥章?9.4%~ 101.6%,平均為100.5%,準確度高。日內(nèi)CV為0.6%~1.0%,日間CV為1.3%左右,精密度好。與質(zhì)譜法比較,y=1.02x-0.5。與GOD-POD法比較,r=0.998,y=1.01x+0.190。

3.輕度溶血、脂血、黃疸、維生素C、氟化鈉、肝素、EDTA和草酸鹽等不干擾本法測定。但嚴重溶血致使紅細胞內(nèi)有機磷酸酯和一些酶類釋放,消耗NADP+,可使葡萄糖測定值下降6.6%~32%。

【臨床意義】 參見“葡萄糖氧化酶法”。

(三)葡萄糖脫氫酶法

葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖脫氫,生成葡萄糖酸(D-葡萄糖酸-δ-內(nèi)酯)。其反應式如下

向反應液中加入變旋酶可縮短反應到達平衡的時間。在反應過程中,NADH的生成量與葡萄糖濃度成正比。

GDH對葡萄糖具有高度特異性,其測定結(jié)果與HK法具有良好的一致性。一般濃度的抗凝劑或防腐劑如肝素、EDTA、檸檬酸鹽、草酸鹽、氟化物和碘乙酸等不干擾測定。膽紅素85.5μmol/L,血紅蛋白950mg/L,維生素C 2g/L,谷胱甘肽200mg/L,尿酸100mg/L,尿素20g/L,肌酐250mg/L等不干擾測定。但當膽紅素342μmol/L和血紅蛋白1g/L時,可使表觀葡萄糖濃度分別增高0.72mmol/L和0.22mmol/L。脂血標本會干擾測定,須做標本對照管。