（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次中最基礎(chǔ)的是其一級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)通常是指蛋白質(zhì)肽鏈中氨基酸的排列順序，即氨基酸序列，考慮到由多個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)和結(jié)合蛋白質(zhì)，嚴(yán)格講蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)該是指蛋白質(zhì)分子內(nèi)以共價(jià)鍵方式形成的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

盡管蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測定，應(yīng)該包括肽鏈中氨基酸殘基序列和非氨基酸的其他組分（糖鏈、脂質(zhì)以及多種多樣的小基團(tuán)、原子的修飾），但是，目前討論蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)仍然是指測定蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列，氨基酸殘基序列測定也是鑒定一個(gè)蛋白質(zhì)分子最為可靠的途徑。目前測定肽鏈氨基酸殘基序列的方法有化學(xué)法、生物學(xué)方法和物理學(xué)方法三大類。

1．化學(xué)法 是最經(jīng)典的，也是較為可靠的。20世紀(jì)40—50年代英國的Francis Sanger實(shí)驗(yàn)室首次使用化學(xué)法成功測定出第一個(gè)完整蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列，很快P．Edman就改進(jìn)了Sanger的測序法，目前測定肽鏈氨基酸殘基序列多采用的是Edman降解法。盡管各種蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸殘基序列千差萬別，但是，蛋白質(zhì)化學(xué)測序法的策略原則基本不變。其測定步驟如下。

（1）首先是被測樣本的分離純化，以及二巰鍵的還原等衍生化。

（2）用專一性強(qiáng)的蛋白水解酶，或用化學(xué)方法斷裂特定的氨基酸殘基形成的肽鍵，得到一組作為降解碎片的肽段。

（3）利用各種類似于蛋白質(zhì)分離純化的方法，對一組肽段進(jìn)行分離純化。

（4）對分離得到的肽段進(jìn)行氨基酸殘基序列測定。

（5）用另一種降解方法，得到另一組肽段，并測定它們的序列。

（6）利用兩組肽段的序列，進(jìn)行全序列的重疊和連接。

（7）肽鏈中二巰鍵的定位。

2．生物學(xué)方法 是目前常用的方法。先確定蛋白質(zhì)肽鏈的DNA序列，然后再由DNA的堿基序列推出肽鏈的氨基酸序列。

3．物理學(xué)方法 測定氨基酸序列的物理學(xué)方法主要有三種：X射線晶體分析、二維核磁共振（NMR）和質(zhì)譜法（MS）。X射線晶體分析和二維核磁共振不僅可以測定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)還可以測定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。在測定分子質(zhì)量較大的肽鏈氨基酸殘基序列時(shí)，質(zhì)譜法經(jīng)常需要與化學(xué)測定的某些步驟聯(lián)合使用，如肽鏈的酶解和所得肽段的分離等。近年，人們建立了基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的氨基酸測序方法。這是根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)測定多肽分子質(zhì)量的極高準(zhǔn)確性而設(shè)計(jì)的，即通過質(zhì)譜技術(shù)先測定某一肽段以及從C-末端或N-末端去除一個(gè)殘基的同一肽段各自的分子量，二者之差值即為末端殘基的分子量，然后與20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的分子量進(jìn)行比較就可以確定末端氨基酸的本質(zhì)了。實(shí)際操作中，從質(zhì)譜上獲得的一系列多肽片段依次相差一個(gè)氨基酸，我們可以很快地確定最初樣品多肽的末端序列。

另外，除細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)外，幾乎所有的蛋白質(zhì)都含有二巰鍵。因此，在測定了肽鏈中氨基酸殘基的序列后，還應(yīng)測定肽鏈中的二巰鍵。經(jīng)典的二巰鍵測定的方法是借助于對角線電泳。其基本原理是：未經(jīng)還原的完整肽鏈經(jīng)酶切后可得到的一組肽段，其中有一些是由二巰鍵連接而成的“工”字形肽段。這組肽段在濾紙上進(jìn)行第一次電泳后，設(shè)法將二巰鍵斷裂，如用甲酸蒸汽處理，再將濾紙轉(zhuǎn)90°進(jìn)行第二次電泳。應(yīng)為兩次電泳的條件相同，“工”字形肽段以外的所有肽段，在兩次電泳后位于濾紙的對角線上，只有“工”字形肽段因二巰鍵斷裂稱為兩條肽段，而且會(huì)在第二次電泳后偏離對角線。從濾紙上取下偏離對角線各個(gè)成對的兩條肽段，分別測定它們的氨基酸組成或氨基酸殘基序列，由此推斷肽鏈內(nèi)或肽鏈間的二巰鍵。

（二）蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)

測定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)最為成熟的方法是X射線晶體衍射法。絕大多數(shù)已經(jīng)獲得的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)（包括第一個(gè)空間結(jié)構(gòu)被測定的蛋白，肌紅蛋白）都是通過此方法測定的。

1．X射線晶體衍射法 早在20世紀(jì)30年代就利用X射線晶體衍射法研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。其原理是：首先，純化的蛋白質(zhì)分子在合適的環(huán)境中進(jìn)行高度有序的排列而形成所謂的單晶。然后用一束X射線照射蛋白晶體中按同樣方式排列的巨大數(shù)目的蛋白分子。一部分射線將在與蛋白分子中精確排列原子的電子云發(fā)生相互作用后散射，或說衍射。如果在距離蛋白晶體一定的位置上放置一個(gè)對X射線敏感的電子探測器，則可以得到一個(gè)反映蛋白質(zhì)分子中不同原子排列方式的衍射圖，通過利用計(jì)算機(jī)軟件將衍射圖進(jìn)行復(fù)雜的數(shù)學(xué)處理后轉(zhuǎn)換成一電子密度圖，根據(jù)所得到的電子密度圖即可解出晶體蛋白分子中的每一個(gè)原子的排列方式。

X射線晶體衍射法分析一般認(rèn)為是用于測定蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，不過它也可結(jié)合其他技術(shù)用于測定蛋白質(zhì)各層次結(jié)構(gòu)以及和其他分子相互作用的情況。對于具有四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)X射線晶體衍射技術(shù)除了可以揭示蛋白質(zhì)中亞基的空間結(jié)構(gòu)外，還可測定各亞基間的相對布局，具有四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)所呈現(xiàn)的變構(gòu)效應(yīng)也全是由X射線晶體衍射技術(shù)所揭示的。

2．二維核磁共振技術(shù) NMR是另一種測定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的方法。2002年為了表彰在NMR研究方面的成績，瑞士科學(xué)家Wüthrich獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。與X射線晶體衍射法不同，被測定的樣本無需結(jié)晶，但樣本要求純度高；測定時(shí)樣本的濃度要高；被測蛋白質(zhì)的分子量不能太高。該技術(shù)利用的是處于一定空間距離范圍之內(nèi)存在相互作用的兩個(gè)或多個(gè)自旋核磁矩不為零的原子核之間在外加一定磁場的作用下各自產(chǎn)生的自旋磁場之間相互影響的現(xiàn)象；并以此判斷兩個(gè)原子之間的空間關(guān)系。在蛋白分子測定中常用的一般是氫原子，由于只有空間上相鄰的氫原子才會(huì)相互作用，所以得到的實(shí)際上是一個(gè)氫原子接觸圖。

3．蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的追蹤 蛋白質(zhì)分子在折疊、去折疊過程中，在與其他分子發(fā)生相互作用的時(shí)候都會(huì)發(fā)生構(gòu)象的調(diào)整。這些變化一般可通過圓二色譜（circular dichrooism，CD）等方法來探測。

（1）圓二色譜法：從本質(zhì)上說，圓二色譜探測的是蛋白質(zhì)分子的不對稱性。蛋白質(zhì)分子的不對稱性來自兩個(gè)方面：一是不對稱碳的大量存在而導(dǎo)致的“構(gòu)型不對稱性”，另一方面是不對稱空間結(jié)構(gòu)（如α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角等結(jié)構(gòu)）的存在而導(dǎo)致的“構(gòu)象不對稱性”。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)特征，當(dāng)兩束偏振方向分別為左旋和右旋的光線通過蛋白溶液時(shí)，這兩束偏振光的吸收率（即透射出來的光與入射進(jìn)去的光強(qiáng)度的比例）是不同的。不同波長處這兩種偏振光的吸收率的差值反映蛋白構(gòu)象組成情況。蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化也可以通過觀察這種吸收率的變化而追蹤。

（2）紅外光譜（IR）和拉曼光譜：蛋白質(zhì)中不同的原子和不同的鍵均對應(yīng)著不同特征的紅外光譜和拉曼光譜，可以從不同角度對蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化進(jìn)行定性或定量探測。