第十章　彌散性血管內(nèi)凝血（DIC）

實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

初步掌握復(fù)制家兔急性DIC動(dòng)物模型的方法，討論急性DIC的發(fā)病機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)原理

耳緣靜脈注入兔腦粉浸液，通過(guò)激活外源性凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致DIC發(fā)生。

實(shí)驗(yàn)對(duì)象及相關(guān)用品

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象

家兔，雌雄不限，體重2.0～2.5kg。

2.實(shí)驗(yàn)相關(guān)用品

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)手術(shù)器械，試管架，試管，刻度離心管，離心機(jī)，BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，BI-2000微循環(huán)圖像分析系統(tǒng)，3%戊巴比妥鈉溶液，4%兔腦粉生理鹽水浸液，3.8%枸櫞酸鈉溶液。

實(shí)驗(yàn)分組

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。

觀測(cè)指標(biāo)

（1）血小板計(jì)數(shù)：急性DIC時(shí)，血小板的消耗大于生成。

（2）凝血相關(guān)指標(biāo)：①活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT），凡是參與凝血活酶生成的任何因子缺陷時(shí)，APTT延長(zhǎng)，如Ⅷ因子、Ⅸ因子、Ⅺ因子、Ⅻ因子缺乏，也見(jiàn)于Ⅴ因子、Ⅹ因子、凝血酶原、纖維蛋白原缺乏；②凝血酶原時(shí)間（PT），急性DIC時(shí)，PT時(shí)間延長(zhǎng)；③血漿魚(yú)精蛋白副凝實(shí)驗(yàn)（3P試驗(yàn)），在繼發(fā)性FDP大分子碎片存在的DIC中，本實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；④血漿纖維蛋白原含量，急性DIC時(shí)，纖維蛋白原明顯減少。

（3）腸系膜微循環(huán)：急性DIC時(shí)，可見(jiàn)血細(xì)胞及血小板形態(tài)、血流速度變化，血栓形成，血漿外滲現(xiàn)象等。

實(shí)驗(yàn)步驟

1.實(shí)驗(yàn)組

（1）家兔稱重，仰臥位固定在兔臺(tái)上。

（2）3%戊巴比妥鈉溶液（1mL/kg）經(jīng)耳緣靜脈注射行全身麻醉。

（3）剪去頸部手術(shù)視野的被毛，常規(guī)暴露氣管，插氣管插管，保持呼吸通暢；分離一側(cè)頸總動(dòng)脈，插入硅膠管，作取血樣本用；分離另一側(cè)頸總動(dòng)脈，行頸總動(dòng)脈插管并連于壓力換能器，在BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上描記血壓。

（4）在右側(cè)腹直肌旁做長(zhǎng)5～8cm的縱向中腹部切口，鈍性分離肌肉，打開(kāi)腹腔后，推開(kāi)大網(wǎng)膜，找出一段游離度較大的小腸腸袢，從腹腔中拉出，放置在BI-2000微循環(huán)圖像分析系統(tǒng)連接的微循環(huán)恒溫灌流槽內(nèi)，使腸系膜均勻平鋪在有機(jī)玻璃觀察環(huán)上，壓上固定板，調(diào)整灌流液液面，使其剛剛覆蓋過(guò)腸系膜。

（5）用BI-2000微循環(huán)圖像分析系統(tǒng)于顯微鏡下觀察腸系膜的正常微循環(huán)。記錄正常狀態(tài)下的血壓。經(jīng)頸動(dòng)脈取血，將最先流出的數(shù)滴血棄之，然后于盛有3.8%枸櫞酸鈉溶液（0.5mL）的離心管中放入兔血4.5mL，上下顛倒混勻，請(qǐng)勿震蕩。先取20μL供血小板計(jì)數(shù)用，其余血液離心15min（3000r/min），取血漿檢測(cè)凝血相關(guān)指標(biāo)。

（6）取4%兔腦粉生理鹽水浸液，按2.0mL/kg計(jì)算，將總量用生理鹽水稀釋至30mL，由耳緣靜脈注射（可用頭皮靜脈針），在15min內(nèi)注完。其注入速度為：第一個(gè)5min以1.0mL/min注入；第二個(gè)5min以2.0mL/min注入；最后5min以3.0 mL/min注入。

（7）用BI-2000微循環(huán)圖像分析系統(tǒng)于顯微鏡10×物鏡下動(dòng)態(tài)觀察腸系膜的微循環(huán)；于40×物鏡下觀察微循環(huán)中血細(xì)胞及血小板形態(tài)、血流速度、血栓形成、血漿外滲現(xiàn)象等。

（8）分別于注射兔腦粉浸液開(kāi)始后15min、45min記錄血壓變化，并由頸總動(dòng)脈采集血樣，檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)和凝血相關(guān)指標(biāo)。

（9）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，打開(kāi)胸腔、腹腔，觀察各臟器的變化。

2.對(duì)照組

將耳緣靜脈注入兔腦粉浸液改為注入等量生理鹽水，注入途徑、總量、速率、觀察指標(biāo)等均與實(shí)驗(yàn)組相同。

注意事項(xiàng)

（1）本實(shí)驗(yàn)中，兔腦粉浸液的制備及注射速度對(duì)實(shí)驗(yàn)成敗影響較大。①兔腦粉浸液的制備：稱取兔腦粉400mg，其活力（PT）不得大于12s，加入生理鹽水10mL，充分?jǐn)噭蚝蠓湃?7℃恒溫水浴內(nèi)孵育60min，每隔15min充分?jǐn)嚢枰淮?，然后離心（1000r/min）5min，取上清液過(guò)濾后，供靜脈注射用。或?qū)⑼媚X凝血活酶凍干制劑稀釋后靜脈注入。②注入兔腦粉浸液的原則是先慢后快，切忌過(guò)快，否則極易造成動(dòng)物猝死。注射過(guò)程中密切觀察動(dòng)物呼吸情況，必要時(shí)酌情調(diào)整注射速度。

（2）每次采集完血樣用生理鹽水沖洗動(dòng)脈插管（5mL注射器）以防管內(nèi)凝血。注意不能使用抗凝劑，以免影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（3）本實(shí)驗(yàn)中所用試劑、血漿樣本及吸管較多，同一吸管只能吸取某一試劑或血漿樣本，避免交叉使用。

（4）如室溫低于20℃，實(shí)驗(yàn)用血漿應(yīng)在37℃恒溫水浴中保溫1min。

實(shí)驗(yàn)報(bào)告要點(diǎn)

（1）實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_，實(shí)驗(yàn)步驟清晰。

（2）實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄完整、準(zhǔn)確。

（3）圍繞實(shí)驗(yàn)結(jié)果展開(kāi)討論。

（4）總結(jié)實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)、教訓(xùn)。

思考題

1.試分析本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生DIC的可能機(jī)制。

2.綜合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，你所復(fù)制的模型屬于DIC的哪個(gè)期？并說(shuō)明原因。

附：

1.血小板計(jì)數(shù)及凝血相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法

（1）血小板計(jì)數(shù)：吸取血小板稀釋液0.38mL于一試管內(nèi)，用血紅蛋白吸管取血20μL立即加入血小板稀釋液中，充分混勻后，用滴管將上述混懸液1小滴滴入計(jì)算室內(nèi)，靜置15min，用高倍鏡計(jì)數(shù)。數(shù)5個(gè)中方格內(nèi)的血小板數(shù)×10⁹/L。

（2）活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）。

①原理：以腦磷脂代替血小板磷脂，白陶土為活化劑，使因子Ⅹ、Ⅺ充分活化，與血漿混合，溫育一定時(shí)間使凝血因子活化，然后加入氯化鈣測(cè)定血漿凝結(jié)時(shí)間。

②方法：將被檢血漿0.2mL加入小試管內(nèi)，置37℃水浴中，再加入白陶土部分凝血活酶試劑（K試液）0.2mL，混勻，孵育3min；加入0.025mol/L氯化鈣溶液0.2mL，同時(shí)開(kāi)動(dòng)秒表，30s后將試管從水浴中取出，傾斜試管，直至液體停止流動(dòng)（呈膠凍狀）或出現(xiàn)白色粗顆粒，即為凝固終點(diǎn)。重復(fù)操作2～3次，取平均值。正常參考值約30s。

（3）凝血酶原時(shí)間（PT）。

①原理：血漿中加入過(guò)量的組織凝血活酶與適量的鈣離子，觀察其凝固時(shí)間，據(jù)此可以估計(jì)血漿中凝血酶原復(fù)合物（因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ）的水平。它是外源性凝血系統(tǒng)基本的篩選實(shí)驗(yàn)。

②方法：取被檢血漿0.1mL加入小試管內(nèi)，置37℃水浴中，再加入P試液0.2mL，開(kāi)動(dòng)秒表，觀察方法同上，測(cè)定凝固時(shí)間。重復(fù)操作2～3次，取平均值。正常參考值為6～8s。

（4）血漿魚(yú)精蛋白副凝實(shí)驗(yàn)（3P試驗(yàn)）。

①原理：魚(yú)精蛋白可分離FDP與纖維蛋白單體結(jié)合的可溶性復(fù)合物使纖維蛋白單體聚合沉淀，呈現(xiàn)纖維絲條。

②方法：被檢血漿0.45mL置于小試管內(nèi)，37℃水浴3min，再向小試管內(nèi)加入1%魚(yú)精蛋白液0.5mL，37℃水浴15min或室溫30min，將小試管輕輕搖動(dòng)，置明亮的光源下，觀察有無(wú)不溶解物質(zhì)，必要時(shí)可用放大鏡觀察。有白色纖維或凝塊為陽(yáng)性，均勻渾濁、無(wú)白色纖維者為陰性。

（5）血漿纖維蛋白原含量（熱沉淀比濁法）。

①原理：血漿經(jīng)pH值為6.3的緩沖液稀釋后置于56℃水浴15min，纖維蛋白原被沉淀而呈現(xiàn)濁度，而其他蛋白質(zhì)仍處于溶解狀態(tài)，于405nm波長(zhǎng)比濁測(cè)定，在一定范圍內(nèi)，纖維蛋白原（包括無(wú)功能的纖維蛋白原、纖維蛋白原降解產(chǎn)物）含量與濁度成正比。

②方法：取3支試管，分別為空白管、實(shí)驗(yàn)管、對(duì)照管，按表10-1操作。

表10-1　血漿纖維蛋白原含量的測(cè)定

將各試管內(nèi)液體旋轉(zhuǎn)混勻。用722分光光度計(jì)（波長(zhǎng)405nm），1cm比色杯，以空白管調(diào)零，讀取第一次吸光度值為A₁，然后3管同置56℃水浴15min，冷卻至室溫，讀取第二次吸光度值為A2。

A₂-A₁＝ΔA，查校正曲線得結(jié)果。

校正曲線的制作：將已知定量血漿配成1.0g/L、2.0g/L、4.0g/L、6.0g/L、8.0g/L溶液，按上述操作，求ΔA，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在8.0g/L范圍內(nèi)呈線性。

2.試劑配制

（1）K試液：實(shí)驗(yàn)前將2%白陶土生理鹽水懸液1份與兔腦磷脂懸液等量混合，作KPTT測(cè)定用。

（2）P試液：實(shí)驗(yàn)前稱取200mg兔腦粉，加入5mL生理鹽水，充分混勻后于37℃恒溫水浴1h。在此過(guò)程中，間歇用玻棒攪拌3～4次，并顛倒混勻，然后離心（1000r/min）5min，吸取上清液，加入等量的0.025mol/L氯化鈣溶液，用前搖勻，作PT測(cè)定用。

（3）KH2PO₄-NaOH緩沖液（pH值6.3）：0.1mol/L KH2PO₄50mL加0.1mol/L NaOH 10.6mL混合，加蒸餾水至100mL。

（吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院　李揚(yáng)）