第十八章　結(jié)核病發(fā)病機(jī)制在動(dòng)物模型 中的研究

一旦有毒力的結(jié)核分枝桿菌在肺中形成了牢固的感染，即可造成終身不愈的潛伏性感染，難以治療。但是與此同時(shí)體內(nèi)卻可產(chǎn)生防止外源性結(jié)核分枝桿菌再次感染的能力（即所謂郭霍現(xiàn)象，亦稱感染性免疫）。近1個(gè)世紀(jì)以來，科研人員對(duì)于結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制曾進(jìn)行了大量的研究，但收效甚微。少數(shù)存在于乳酪樣病變的結(jié)核分枝桿菌何故能逃避體內(nèi)活化的細(xì)胞免疫機(jī)制的殺菌作用，至今仍是一無所知。

從世界各地分離的結(jié)核分枝桿菌對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒力差異很大。對(duì)于有關(guān)決定此種差異的遺傳和分子機(jī)制所知不多。早期在豚鼠中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，許多耐藥的結(jié)核分枝桿菌的致病性較之敏感菌株為低，但在人類中的情況就并非如此。事實(shí)上多數(shù)的結(jié)核分枝桿菌的多種藥物耐藥菌（MDR－TB）仍可保留其感染性和毒力，特別是對(duì)HIV感染的個(gè)體。然而即使是具有免疫活性的接觸者仍是難以免于發(fā)病。而且合并有HIV和結(jié)核病的疾病流行將構(gòu)成在世界范圍內(nèi)消滅結(jié)核病的巨大威脅，迫使世界衛(wèi)生組織（WHO）宣布結(jié)核病為“全球公共衛(wèi)生的緊急狀況”。

一、結(jié)核分枝桿菌毒力的測(cè)定

結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株毒力的測(cè)定，一般是將Lowenstein－Jensen培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)物制成細(xì)菌懸液，光濁度比色法標(biāo)準(zhǔn)化，增量的懸液注射至家兔或豚鼠，以被攻擊動(dòng)物的平均死亡時(shí)間表示毒力的大小。雖然1～2個(gè)活菌即可使豚鼠致死，但一般的接種物中多含有百萬倍的細(xì)菌用以進(jìn)行攻擊，使實(shí)驗(yàn)?zāi)茉?～12個(gè)月內(nèi)完成。在某些實(shí)驗(yàn)中，尚可用極大量的細(xì)菌攻擊動(dòng)物而使死亡百分率能在30d內(nèi)測(cè)出，但是這種方法產(chǎn)生的超級(jí)全身性感染與人類中自然獲得的疾病是截然不同的。另外還可用肉眼觀察肺、肝、脾和淋巴結(jié)中結(jié)核病變的數(shù)量，而使此種毒力試驗(yàn)較為準(zhǔn)確，即擬定一人為的0～4＋病變等級(jí)，或計(jì)數(shù)X線檢查時(shí)肺中病變的數(shù)目。這些主觀檢定法也可進(jìn)一步通過顯微鏡檢查個(gè)別肺中病變而使之更為可靠，即用Gaffky型分級(jí)，或用選擇臟器勻漿連續(xù)活菌計(jì)數(shù)。在后一情況下，可用相對(duì)死亡率或在標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間內(nèi)選擇臟器中細(xì)菌生長(zhǎng)的數(shù)量來檢定毒力。這種方法可應(yīng)用亞致死量的分枝桿菌直接注入肺中，因而與自然獲得的人類疾病比較接近。

在毒力測(cè)定時(shí)，如果結(jié)核分枝桿菌分離物長(zhǎng)期保存于培養(yǎng)基，特別是含有聚氧乙烯80（polysorbate 80）之類的去垢劑（可使形成光滑型單細(xì)胞細(xì)菌懸液），細(xì)菌將逐步減毒。最后細(xì)菌分離物可以完全對(duì)小鼠和豚鼠無毒。與此同時(shí)并有遺傳學(xué)、抗原性和超微結(jié)構(gòu)上的改變。這些改變中很多涉及細(xì)胞壁類脂的喪失，這是因?yàn)榫垩跻蚁?duì)菌體的去垢劑作用所致。

近交小鼠對(duì)分枝桿菌感染的抵抗力變化較大，這種反應(yīng)上的差異已證實(shí)取決于1對(duì)染色體上bcg^r基因的存在與否。早期研究這一基因在自然抵抗力表達(dá)上的作用時(shí)，系用小劑量接種量（10⁴菌落形成單位CU F）BCG Montoreal靜脈接種，在具有bcg^r基因的小鼠（DBA/2.CBA，C3 H）中不能發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，但在C57BL/6和BA LB/c（bcg^s）小鼠中則有廣泛的生長(zhǎng)。開始時(shí)原本認(rèn)為這是由于單一染色體所致，但以后通過回交實(shí)驗(yàn)證實(shí)涉及一個(gè)以上的基因位點(diǎn)，而且發(fā)現(xiàn)在DBA/2（bcg^r）小鼠脾臟內(nèi)也有一些BCG Montoreal的生長(zhǎng)，但其生長(zhǎng)不及在C57BL/6或BA LB/c（bcg^s）小鼠中所見者。bcg^r基因?qū)ζ渌鄶?shù)的BCG菌株或有毒力的結(jié)核分枝桿菌菌株的生長(zhǎng)并無影響。如將BCG Momtoreal的劑量增至10⁶ CFU，則可全部消除bcg^r基因的影響。bcg^r基因阻止經(jīng)BCG免疫DBA/2小鼠保護(hù)性T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。不過脾臟中生長(zhǎng)量的減少卻可影響免疫的持續(xù)時(shí)間。特別是在以大量結(jié)核菌攻擊的情況下更為明顯。在人類中尋求與bcg ^r基因相當(dāng)?shù)幕虿⑽闯晒Α?/p>

bcg^r基因的作用一般表現(xiàn)在T細(xì)胞介導(dǎo)免疫產(chǎn)生以前。這種情況與天然抗結(jié)核抵抗力不受T細(xì)胞耗竭或亞致死量全身照射的影響的報(bào)告是一致的，而這兩種處理方法一般均已知可消除已建立的細(xì)胞免疫。

二、結(jié)核分枝桿菌的毒力因子

毒力純粹是一種細(xì)菌特有的活性，但其表現(xiàn)尚需取決于復(fù)雜的宿主－寄生物相互作用過程。結(jié)核感染可以視為兩方面的競(jìng)賽，一方面是病原菌企圖在肺中建力牢固的基地；另一方面則是產(chǎn)生能限制病原體進(jìn)一步增殖和侵犯血流及其他部位的細(xì)胞防御機(jī)制。有毒力和減毒的結(jié)核分枝桿菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的早期生長(zhǎng)速度基本上是相同的，但當(dāng)細(xì)胞免疫應(yīng)答一旦形成，則只有有毒力的細(xì)菌可繼續(xù)在肺內(nèi)增殖，直至感染達(dá)到致死程度，毒力較低的菌株則先是處于長(zhǎng)期的制菌狀態(tài)，然后繼之以緩慢下降時(shí)期，直至感染因子完全由組織中清除為止。在95%具有免疫活性的個(gè)體中，自然抵抗力的形成是由于持續(xù)性（潛伏）帶菌狀態(tài)的建立，這種狀態(tài)能保護(hù)宿主免受致死性的感染。同時(shí)也能對(duì)同一細(xì)菌的外源性再次感染提供終身保護(hù)力以及對(duì)相關(guān)菌株的交叉保護(hù)力。在這些情況下，不大可能是由單一的毒力因子來決定如此復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用過程的。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌特定菌株的毒力取決于許多實(shí)驗(yàn)變數(shù)，如宿主品系、其遺傳背景、免疫活性和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，以及用以攻擊接種物的制備方式、接種量的大小和接種途徑和是否有從中介入的病原體等。此外，由瀕死的動(dòng)物體內(nèi)取出細(xì)菌的毒力一般較之在體外生長(zhǎng)者為大，提示前者能產(chǎn)生在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)細(xì)菌所不具備或受到限制的毒力因子。但是體內(nèi)生長(zhǎng)的細(xì)菌卻要受到組織勻漿、酶消化差速離心等方法處理，使其由組織碎片中釋出，如此就有可能形成細(xì)胞聚集，從而使細(xì)菌聚集于肺部毛細(xì)血管。這樣使其較之由含有聚氧乙烯的培養(yǎng)基培養(yǎng)的單個(gè)細(xì)菌懸液的毒力更強(qiáng)。

結(jié)核分枝桿菌如何殺滅吞噬細(xì)胞所知不多，反之亦然。中等量的有毒力結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株可以殺死小鼠的正常巨噬細(xì)胞，而加熱殺死的結(jié)核分枝桿菌及其超聲處理提取物則對(duì)小鼠正常巨噬細(xì)胞完全無毒性作用。一般均知，有毒的結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生許多毒性硫脂和分枝苷酸（mycoside）以及索狀因子。這些復(fù)雜類脂在誘發(fā)疾病中的作用仍不甚清楚，其中有些可防止病原體免受活化的氧和氮代謝中間產(chǎn)物的殺菌作用，另有一些則可阻止或抑制溶酶體與吞噬體的融合。有的分枝桿菌能破壞吞噬體膜，從而使有毒的細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。不論有關(guān)機(jī)制如何，最后的結(jié)果是有毒力的結(jié)核分枝桿菌能在吞噬細(xì)胞的防護(hù)性微環(huán)境中持續(xù)的生長(zhǎng)，一項(xiàng)有關(guān)結(jié)核感染免疫應(yīng)答的應(yīng)予以重視的事實(shí)是，在肝臟和脾臟中免疫活化細(xì)胞防御機(jī)制能使90%以上的有毒力細(xì)菌滅活；但在肺臟內(nèi)對(duì)相同細(xì)菌的生長(zhǎng)很少有影響。即使在結(jié)核感染的脾臟中能顯示明顯的T細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，有毒結(jié)核分枝桿菌是否能在肺臟及其相關(guān)淋巴結(jié)中完全被消滅，還是有問題的。

三、結(jié)核分枝桿菌毒力基因的克隆化

尚未發(fā)現(xiàn)有決定結(jié)核分枝桿菌毒力因子產(chǎn)生的基因，這種基因應(yīng)當(dāng)是能作用于細(xì)菌在肺部吞噬細(xì)胞中的生存和生長(zhǎng)的能力，而對(duì)無毒力菌株則因不能產(chǎn)生必需的毒力因子而被殺滅。結(jié)核分枝桿菌對(duì)小鼠有毒力的無毒菌株H37Ra不能在天然易感的C57BL/6（bcg^s）小鼠的肺中生存，并且發(fā)生緩慢而持續(xù)的活力下降，直至感染完全在組織中消滅。即使是免疫缺陷的小鼠，分枝桿菌H37Ra也不能使其致死。因此這一菌株就成為研究H37Rv菌株可能毒力基因的理想菌株。H37Rv和H37Ra原本均來源于同一親代菌株H37，兩者的區(qū)別在于菌落形態(tài)和對(duì)家兔和豚鼠的毒力有所不同。這樣就使H37Ra成為研究H37Rv毒力基因的良好工具，可利用新近發(fā)展的穿梭質(zhì)粒來完成所需的傳遞。

（一）克隆化步驟

有毒力的結(jié)核分枝桿菌H37Rv在Proskauer和Beck培養(yǎng)基中生長(zhǎng)14d后，由表面生長(zhǎng)菌膜中以酚－氯仿提取細(xì)菌染色體DNA，在Braun勻漿器中機(jī)械處理破壞，然后用Sau3A消化基因組DNA，所形成的50kb片段在包裝至λ－噬菌體頭部并轉(zhuǎn)導(dǎo)至大腸埃希菌以前，將其5′端連接至pYUB178整合穿梭質(zhì)粒，以電穿孔法（electroporation）處理，使H37Rv文庫(kù)置入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的H37Ra，將重組體混合物凍存，以備以后在小鼠中檢測(cè)毒力。

（二）毒力基因的檢測(cè)

H37Ra重組混合體足夠代表整個(gè)H37Rv的基因組，可將其靜脈注射至小鼠，定期殺死動(dòng)物，并測(cè)定肺和脾中仍存有的重組體的數(shù)目，與感染了相應(yīng)載體對(duì)照（僅為質(zhì)粒DNA）的動(dòng)物進(jìn)行比較。這種體內(nèi)檢測(cè)重組混合體的方法可以避免使用個(gè)別篩選大量毒力增強(qiáng)重組體的檢測(cè)法，帶有無關(guān)基因的重組體相當(dāng)快地由脾中消滅；而帶有H37Rv毒力基因者則可在體內(nèi)生存。所發(fā)現(xiàn)的重組體經(jīng)過在另一宿主體內(nèi)傳代后，3個(gè)月后脾中存在的重組體數(shù)目較之載體對(duì)照者為多，分離物以Southern印跡法檢查。而且連接片段分析證實(shí)這些分離物都共有相同的25kb的DNA片段。重疊黏粒再次克隆至H37Ra，所有帶有重疊黏粒的重組體都可在體內(nèi)增殖，但帶有非重疊黏粒者則不能在體內(nèi)增殖。這些提示在小鼠中選擇的重組體具有一個(gè)或一個(gè)以上的毒力基因（稱為ivg基因以代表體內(nèi)生長(zhǎng)），此種基因能保證細(xì)菌在正常小鼠脾臟中的生存和生長(zhǎng)。以后用這些重組體克隆進(jìn)行巨噬細(xì)胞感染的研究證明，這些帶有毒力基因的細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)可持續(xù)達(dá)7d之久。但載體對(duì)照者則不能在細(xì)胞內(nèi)增殖。

四、bcg基因在分枝桿菌感染中的作用

正式遺傳研究結(jié)果表明，小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌的抵抗力受單一顯性基因的控制。雖然這種抵抗力基因的性質(zhì)尚不清楚，但可設(shè)想小鼠染色體1上的bcg基因可能與之有關(guān)。

（一）bcg基因的遺傳分析

用所有近交系小鼠對(duì)BCG易感性的觀察證明在bcg細(xì)胞內(nèi)增殖方面可以區(qū)分為兩種類型。提示BCG在小鼠中的這種不能控制的特性是受到單一基因的控制。F1，F(xiàn)2和回交動(dòng)物（由有抵抗力的A/J與易感的B10A親代小鼠交配生成）的正式分離分析結(jié)果證實(shí)了這一推斷。所有的（B10.A x A/J）F1小鼠、約50%的（B10.A x A/J）F1x B10.A小鼠，以及約75%的F2小鼠均對(duì)BCG的增殖無反應(yīng)。這些結(jié)果是與存在有一稱之為bcg的單一作用于BCG抵抗力的顯性位點(diǎn)一致的。在表型上可區(qū)別為兩個(gè)等位基因的表現(xiàn)。即抵抗力等位基因（bcg^r）和易感性等位基因（bcg^s）。這一位點(diǎn)可能是位于小鼠的19對(duì)常染色體中的一個(gè)染色體上。

（二）bcg基因的作圖

bcg基因在染色體上的具體位置是通過兩個(gè)重組體近交品系（recombinant inbred strain，RIS）的連鎖分析而得以確定的。這兩個(gè)RIS分別是來源于BCG－敏感的C57BL/6親代的BXD和來源于BCG－抵抗性DBA/2和C3 H/He親代的BX H。RIS是由F2代的兄妹交配而形成。每一RIS都代表許多發(fā)生于親代品系染色體間的重組過程。在染色體上密切連鎖的親代特異性等位基因在很多RIS中都是一起被檢出，而未連鎖的基因則在RIS中隨機(jī)分離。對(duì)于所有的RIS中這兩種基因親代特異性等位基因的出現(xiàn)情況（即所謂品系分布程式）進(jìn)行比較，可以確定這些位點(diǎn)是否連鎖。由bcg^r和bcg^s等位基因在BXD和BX H RIS的品系分布程式得知，bcg位點(diǎn)位于小鼠染色體1的近側(cè)區(qū)，在以往確定的基因標(biāo)記Idh－1和Pep－3之間。

bcg基因表現(xiàn)型的一項(xiàng)重要方面為其嚴(yán)格控制分枝桿菌在網(wǎng)狀內(nèi)皮組織中早期生長(zhǎng)的能力。此外，針對(duì)分枝桿菌感染的獲得性免疫的后期則是主要受控于小鼠染色體17上的H－2基因。由此可見，小鼠中的分枝桿菌疾病的后果是幾種宿主基因相互作用的結(jié)果。

（三）巨噬細(xì)胞上表達(dá)的bcg基因

bcg基因調(diào)節(jié)許多抗原性和種系發(fā)育上各不相同細(xì)胞內(nèi)寄生病原體的早期非免疫性抵抗力的事實(shí)，提示巨噬細(xì)胞是表達(dá)此種基因的細(xì)胞類型，Gros等報(bào)告，bcg基因型在一一對(duì)900R照射有抵抗力的成熟巨噬細(xì)胞上表達(dá)。相似的結(jié)果亦可見于鼠傷寒沙門菌和杜氏利什曼原蟲感染?，F(xiàn)已證實(shí)表達(dá)Bcg基因的巨噬細(xì)胞能有效地降低BCG、鳥分枝桿菌、細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌和恥垢分枝桿菌以及杜氏利什曼原蟲和鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)。

Bucchman，Blackwell，Zwilling等人分別檢測(cè)了Bcg同類品系小鼠巨噬細(xì)胞活化的功能性和表型參數(shù)標(biāo)記。由具有抵抗力的小鼠中分離的巨噬細(xì)胞較之由易感小鼠中分離者，在BCG被吞噬或在γ－干擾素（IFN－γ）刺激后，具有更大力度的己糖一磷酸支路和呼吸爆發(fā)活性。與這些結(jié)果相一致的是，有抵抗力動(dòng)物的巨噬細(xì)胞在其他標(biāo)記，如Ⅱ類Ia抗原、ACM.1和5′－核苷酸酶、脂多糖（LPS）誘發(fā)的腫瘤壞死因子（TNF）的產(chǎn)生和對(duì)抗原特異性和非特異性T細(xì)胞增殖的支持等，都有高水平的表達(dá)，另有兩個(gè)由bcg同類系小鼠品系的無限增殖化骨髓巨噬細(xì)胞形成的克隆化巨噬細(xì)胞株，即B10S（bcg^s）和B10R（bcg^r）亦可用以分析bcg基因的分子特征。B10R－抵抗性細(xì)胞株與易感性的B10S細(xì)胞相比較，固有地表達(dá)增強(qiáng)的殺菌活性和高水平的IAβmRNA和Ia抗原。同樣用IFN－γ處理后可在48h后誘導(dǎo)B10R的最大限度的Ia抗原表達(dá)，但在B10S巨噬細(xì)胞中僅在72h后方始有Ia抗原的表達(dá)。這種稱之為“多效效應(yīng)（pleiotrophic effect）”的bcg基因效應(yīng)提示，由抵抗性小鼠中分離的巨噬細(xì)胞系在基因的控制下轉(zhuǎn)向于啟動(dòng)化的狀況。雖然尚未發(fā)現(xiàn)有任何參數(shù)與針對(duì)感染細(xì)菌的天然抵抗力有關(guān)，也未鑒定出任何可能的基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)，但也有一些可以作為基因產(chǎn)物的研究報(bào)告。

（四）bcg基因附近的高分辨基因作圖

bcg基因是在研究傳染病宿主遺傳學(xué)時(shí)所用基因中的一例。有關(guān)這一位點(diǎn)的表型表達(dá)所知甚多，但尚未鑒定出其基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)。此種基因可用一種稱之為反向遺傳學(xué)（利用基因序列資料反過來研究體內(nèi)的遺傳學(xué)效應(yīng)）、定位克隆化（positional cloning）或基因搜尋（gene hunting）方法由染色體位置上克隆化?？寺』牟襟E包括：①在表型確定的位點(diǎn)附近進(jìn)行高分辨基因作圖；②通過基因分析確定位點(diǎn)基因組區(qū)域的長(zhǎng)范圍物理作圖；③減數(shù)分裂圖中緊密連鎖兩標(biāo)記側(cè)翼的整個(gè)基因組區(qū)域的克隆化；④由此克隆化的基因組片段分離出候選基因序列；⑤最適合表型確定位點(diǎn)特征候選基因的鑒定。

帶有bcg基因染色體片段的高分辨基因圖的建立在定位克隆法的成功應(yīng)用上至關(guān)重要。最為理想的基因作圖最好是每個(gè)標(biāo)記隔開0.1厘摩（cM），如果認(rèn)為重組是均勻地沿著染色體片段發(fā)生的，則這就意味著最少也有1 000個(gè)信息減數(shù)分裂過程可在基因?qū)嶒?yàn)中進(jìn)行分析。而且如果重組熱點(diǎn)或交換抑制發(fā)生于所研究的染色體片段時(shí)，這種數(shù)目還會(huì)有所增加。雖可應(yīng)用現(xiàn)有的RIS，但仍需生成許多回交動(dòng)物。所有用于構(gòu)建基因圖的小鼠必須有其bcg^s和bcg^r等位基因明顯和確切的表達(dá)。

初步實(shí)驗(yàn)證實(shí)有5個(gè)克隆基因，即Cryg2（Len2），F(xiàn)n，Alpi，Acrg，Vil位于小鼠1對(duì)染色體近側(cè)區(qū)Bcg基因的6cM以內(nèi)。這些結(jié)果在以后的作圖實(shí)驗(yàn)中有所擴(kuò)展，并且確切地證明bcg系位于一群細(xì)胞骨架和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白之內(nèi)，這一觀察結(jié)果促使推測(cè)認(rèn)為bcg本身即可編碼結(jié)構(gòu)蛋白。更為重要的是，過去關(guān)于Bcg位置上30cM基因間隔已得到精確化，成為基因Tnp1和Des之間的間隔為1.1cM。以后又發(fā)現(xiàn)：①在350個(gè)芯息性減數(shù)分裂過程中并未發(fā)現(xiàn)Vil編碼絨毛蛋白（villi）的基因和Bcg之間的重組，所以Vil是最靠近bcg位點(diǎn)的標(biāo)記。②小鼠和人類基因圖的比較分析證實(shí)，所有小鼠染色體1上連鎖于bcg基因位點(diǎn)的人類同源物均系同線存在于人類染色體2上的端粒末端，即q32－qter區(qū)。但也有可能，在人類染色體2q的細(xì)胞遺傳學(xué)定位分辨力范圍內(nèi)，人類和小鼠基因組間這些基因的次序仍是保守性的。由上述的一些觀察可知，bcg本身就是一種超越種系的保守性連鎖基因群，而且人類中的Bcg同源物很有可能在染色體2q的端粒區(qū)發(fā)現(xiàn)，這樣就為研究人類結(jié)核易感性基因提供了靶區(qū)域。

以后的基因作圖實(shí)驗(yàn)則是針對(duì)確定bcg和Vil之間的交換及增加bcg所在地1.1cM間隔標(biāo)記密度。通過1 424個(gè)信息性減數(shù)分裂過程的分析得知，在Vil和bcg之間并未發(fā)現(xiàn)重組，提示這兩種基因緊密連鎖，也可能是同一基因。不過后一可能性可能被排除，因?yàn)閂il基因表達(dá)的組織分布程式并不與Bcg基因中所預(yù)期者相關(guān)。

（五）bcg附近的物理作圖

連接緊密連鎖于bcg側(cè)翼基因標(biāo)記的長(zhǎng)距離物理圖譜的構(gòu)建為其克隆化的主要先決條件。應(yīng)用脈沖凝膠電泳（PFGE）和熒光原位雜交（FISH）技術(shù)可以構(gòu)建成含有7個(gè)在基因圖上緊密連鎖標(biāo)記的物理圖譜。其中有兩個(gè)標(biāo)記，即Vil和λMm1C165（這兩標(biāo)記不與Bcg，D1Mcg105和Tnp 1發(fā)生重組）已證實(shí)分別位于bcg近側(cè)的0.1 c M和0.8 c M處。λMm1C136，Des，Inha則分別位于Bcg遠(yuǎn)側(cè)的0.2 c M，0.5 c M和0.6 c M處。以后使用的方法為首先獲得可用于這7種固定位點(diǎn)的噬菌體和黏?；蚪M克隆，然后再分析這些大型插入基因組克隆是否有罕用限制性內(nèi)切酶NotI，MluI或Bss HII的存在，并且含有這些罕用內(nèi)切酶部位的DN A片段均須亞克隆化以供進(jìn)一步分析。獲取位于罕用內(nèi)切酶部位兩側(cè)的DN A探針，并且以此應(yīng)用于Southern印跡法，其中小鼠基因組DN A用相應(yīng)的罕用限制性內(nèi)切酶消化。因?yàn)樘结樝涤珊庇脙?nèi)切酶部位的兩側(cè)獲取，故能保證檢出Southern印跡法中最大長(zhǎng)度的限制性片段。此種方法的目的在于鑒定能與來源于兩個(gè)鄰近固定位點(diǎn)（如Vil和D1Mcg105或λMm1C136和Des）的探針發(fā)生雜交的DN A片段。如果兩個(gè)探針與同一限制性片段發(fā)生雜交，則隔開這些探針的最大物理距離即是限制性片段的長(zhǎng)度。

由于緊接bcg的近側(cè)區(qū)內(nèi)有一群罕用內(nèi)切酶部位聚集，所以bcg基因染色體區(qū)域圖譜的建立手續(xù)極繁而且費(fèi)時(shí)。這些基因的聚集多發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄花性基因的5′端區(qū)域，因而很有可能bcg是位于小鼠染色體1中的富含基因的部位。由于有無數(shù)罕用內(nèi)切酶部位的存在，故不可能用PFGE來連接Vil區(qū)和λMm1C136－Des/Inha區(qū)，而必須用分裂間期作圖來完成。分隔由Des至Vil間的物理距離測(cè)出為950 kb，這一距離較之原由基因分析者為大?？紤]到基因距離和物理距離間的差異，很有可能是在這一染色體片段中的交換被抑制。與之不同的是，Vil近側(cè)端的物理距離則與由基因分析所推定者相同，即用PFGE測(cè)出的由Tnp1至D1 Mcg105為1 000 kb，至λMm1C165為160 kb，至Vil為180 kb。準(zhǔn)確評(píng)估分隔D1 Mcg105與λMm1C165，Vil和λMm1C136間的物理距離后，即可開始對(duì)bcg基因的基因組區(qū)域進(jìn)行克隆化。

（六）帶有bcg基因組間隔轉(zhuǎn)錄單位的克隆化

bcg基因克隆化的下一步驟為分離兩個(gè)酵母人工染色體（Y AC）克隆以用作文庫(kù)進(jìn)入探針。已經(jīng)分離出兩個(gè)含有小鼠染色體1上跨越總共400 kb連續(xù)性DN A插入片段的Y AC克隆。Y AC插入片段的物理作圖與相應(yīng)基因組區(qū)域物理作圖的比較證實(shí)，這些插入片段的確代表了基因組DN A。將兩Y AC插入片段中的DN A亞克隆化至黏粒和噬菌體載體，并用外顯子擴(kuò)增（axon amplification）技術(shù)分析轉(zhuǎn)錄單位的表達(dá)。

外顯子擴(kuò)增的基礎(chǔ)是，5′和3′端剪接位點(diǎn)決定由一內(nèi)含子隔開的兩個(gè)外顯子的正確剪接過程，而不依賴于分子密度。例如，可以構(gòu)建成一種剪接載體，使其在HIV－tat基因內(nèi)含子內(nèi)有一特殊的克隆位點(diǎn)，這種內(nèi)含子的側(cè)翼序列和剪接位點(diǎn)為家兔β^－珠蛋白基因的另一內(nèi)含子所替代。在外顯子擴(kuò)增時(shí)，將具有剪接活性的外顯子序列克隆至載體。然后將這種構(gòu)建物轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞，其中高水平的插入轉(zhuǎn)錄可由剪接載體中所含有的SV40qi啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)。對(duì)于異種全長(zhǎng)RNA處理成無內(nèi)含子的RNA應(yīng)當(dāng)視為正規(guī)細(xì)胞代謝的一部分。由轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離胞質(zhì)RNA，并用對(duì)側(cè)翼λ珠蛋白載體序列特異的兩個(gè)寡核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增原始基因組中的任何一種外顯子。

應(yīng)用外顯子擴(kuò)增，可以由來源于YAC黏?？寺≈锌偣卜蛛x出22種外顯子。應(yīng)用序列比較、Northern分析、互補(bǔ)DNA（cDNA）文庫(kù)篩選，可將這些外顯子區(qū)分為7組密切連鎖于bcg的獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位，其中6個(gè)轉(zhuǎn)錄單位代表新的基因；一個(gè)外顯子系來源于Vil基因。已分離出這6個(gè)新基因的全長(zhǎng)cDNA克隆，并用以確定這些基因的組織特異性表達(dá)程式。其中有一基因表現(xiàn)已知能表型表達(dá)bcg的組織和細(xì)胞（肝、脾和巨噬細(xì)胞）上的RNA。由于其染色體位置及其表達(dá)程式，此種基因已被認(rèn)為是bcg基因的最有可能的候選者，并已命名為“天然抵抗力相關(guān)性巨噬細(xì)胞蛋白基因”（Nramp）。

計(jì)算機(jī)協(xié)助的Nramp序列分析表明，這種基因編碼一預(yù)期分子量為53×10³的蛋白。其預(yù)期的結(jié)構(gòu)特征提示它是一種膜結(jié)合的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，Nramp蛋白含有10個(gè)跨膜功能區(qū)（TM），2個(gè)可能的N－連鎖糖基化部位和2個(gè)可能通過蛋白激酶C磷酸化的部位。所檢測(cè)的27株bcg^r和bcg^s的Nramp cDNA側(cè)序結(jié)果表明，對(duì)感染的易感性與TM2中非保守性Gly－105至Asp－105的置換有關(guān)。故可設(shè)想，Gly為帶電荷的Asp殘基的置換能影響B(tài)CG易感小鼠的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能，這也的確是一種疾病突變。

Nramp蛋白的另一重要特征為在TM6和YM7之間有一保守性基序，稱為“結(jié)合蛋白依賴性轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)內(nèi)膜成分特征”。這一基序的作用是將結(jié)合和水解腺苷三磷酸的亞單位耦聯(lián)至細(xì)菌通透酶。在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）的CmA基因（具有攝取硝酸鹽功能通透酶的作用）中，也可檢出有相同的基序。雖然Nramp和CmA在核苷酸和氨基酸水平上的一級(jí)序列同源性并不大，但在TM功能區(qū)的大小和數(shù)目，特別是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基序上卻有結(jié)構(gòu)上的相似性。這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似性提示Nramp也有濃縮硝酸鹽/亞硝酸鹽的作用。此種推論是很有意義的，因?yàn)橐延惺聦?shí)表明一氧化氮和有關(guān)的反應(yīng)性氮代謝中間產(chǎn)物（RNI）與巨噬細(xì)胞破壞有毒力的結(jié)核分枝桿菌相關(guān)。但是RNI產(chǎn)生的增強(qiáng)是否為bcg基因所介導(dǎo)仍不清楚，而且也難以將Bcg基因的多效效應(yīng)歸因于一氧化氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在Nramp氨基末端序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)Src同源的3′－結(jié)合功能區(qū)，促使有的研究者設(shè)想Nramp蛋白可能與信息傳導(dǎo)有關(guān)。

（七）人類bcg同源物的搜尋

為了確定人類Bcg同源物能否影響對(duì)結(jié)核病的易感性，首先必須制備針對(duì)人類染色體2q35上小鼠緊密連鎖Bcg位點(diǎn)的人類同源物VIL，TNP，DES的多態(tài)性DNA探針。此外尚加入不與2q35區(qū)域基因連鎖并位于人類染色體2q端粒頂端的標(biāo)記以作為內(nèi)部對(duì)照，然后根據(jù)檢出的多態(tài)性對(duì)親代和家庭成員進(jìn)行基因標(biāo)記的分型。

連鎖分析的目的在于估計(jì)兩個(gè)位點(diǎn)間的重組頻率（Θ），可用分析的最大可能性法檢測(cè)Θ的觀察估計(jì)值小于50%，即根據(jù)所觀察的家系分布的概率，以Θ的最大可能性估計(jì)值來測(cè)定連鎖。計(jì)算優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)值（lod score）（奇數(shù)比率的log₁₀），優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)值小于－2者即可排除連鎖的可能性，而大于＋3者則為兩位點(diǎn)連鎖提供有意義的事實(shí)依據(jù)。這種分析結(jié)果表明，在所檢查的家系中，對(duì)結(jié)核病易感性與染色體2q端粒頂端連鎖的可能性已被排除。但是以基因標(biāo)記所作有關(guān)bcg基因的人類同源物密切連鎖的結(jié)果則較為有意義。

就這些位點(diǎn)而言，已發(fā)現(xiàn)在CRYG基因群、T NF和結(jié)核易感性特征之間有連鎖。在有些患結(jié)核病的家族中發(fā)現(xiàn)疾病與染色體2q35基因標(biāo)記有連鎖。優(yōu)勢(shì)級(jí)數(shù)值顯示這種連鎖主要發(fā)生于“流行病”家族，即在流行暴發(fā)時(shí)所有的家庭成員均與結(jié)核分枝桿菌接觸過。而在“地方病”家族，即不同的家族成員在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)個(gè)別地患有結(jié)核病，一般這種連鎖不存在或優(yōu)勢(shì)級(jí)數(shù)值為負(fù)值。

在T NP易感性之間可以發(fā)現(xiàn)有最高的連鎖值和最低的重組部分。Schurr等獲得了人類Nramp的c DN A，他們應(yīng)用在Y AC克隆中的基因作圖證實(shí)Nramp的確存在于染色體2q35，而且也闡明了相應(yīng)基因的外顯子－內(nèi)含子結(jié)構(gòu)及外顯子特異性引物。合并使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性和直接測(cè)序技術(shù)，在人類Nramp基因中能確定許多多態(tài)性變異體。這些多態(tài)性目前正在測(cè)試其與結(jié)核易感性特征的協(xié)同分離（co－segregation），而且將為人類中的bcg同源體在對(duì)結(jié)核易感性的作用上提供結(jié)論性的答案。

（八）分枝桿菌獲得性免疫的調(diào)節(jié)

已知主要組織相容性復(fù)合體（M HC）基因能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，而且是目前已知多態(tài)性表現(xiàn)最為普遍的基因。因此，不同的H－2或人類淋巴細(xì)胞抗原（H L A）等位基因必然與宿主所形成細(xì)胞免疫應(yīng)答的類型和程度有關(guān)。但是，H－2基因與分枝桿菌感染免疫應(yīng)答變異的連鎖方面極難以判定，除非是用bcg易感背景的H－2同類系品系進(jìn)行研究。有很多實(shí)例證明H－2基因?qū)σ赘兴拗髅庖邞?yīng)答的作用，包括肉芽腫的形成和鼠麻風(fēng)分枝桿菌感染過程中的細(xì)菌清除作用，BCG的32×10³抗原刺激后IFN－γ的產(chǎn)生、對(duì)致死性結(jié)核分枝桿菌的易感性和BCG免疫接種后的保護(hù)效應(yīng)。此外也有報(bào)告H L A－DR和H L A－DQ基因在麻風(fēng)時(shí)對(duì)保護(hù)性和抑制性免疫的影響。

bcg基因控制著一種未經(jīng)鑒定的巨噬細(xì)胞生化過程，這種過程有較快地活化殺滅分枝桿菌功能。此外，這種基因也能通過增強(qiáng)Ⅰa抗原的表達(dá)以及bcg^r提呈抗原至T細(xì)胞的超級(jí)能力，從而影響獲得性免疫應(yīng)答。在BCG感染過程中，BA LB/c bcg ^r小鼠與bcg^s小鼠相比較，能發(fā)生更為顯著的純化單白衍生物（PPD）－特異性T細(xì)胞增殖以及白細(xì)胞介素－2（IL－2）產(chǎn)生的增加。Schurr等發(fā)現(xiàn)，如用大劑量的BCG感染小鼠，由bcg^s小鼠脾中分離的巨噬細(xì)胞可在體外抑制T細(xì)胞增殖。抑制信號(hào)是一種主要的機(jī)制，因?yàn)樵谟衎cg^r巨噬細(xì)胞存在的情況下，共同培養(yǎng)的bcg³巨噬細(xì)胞能消除T細(xì)胞增殖。雖這種抑制作用的機(jī)制尚不清楚，但現(xiàn)有資料提示，Bcg基因可以通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化及抑制作用而影響T細(xì)胞應(yīng)答。

（余傳霖）

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