原生質體培養(yǎng)_關于劉大鈞的故事

一般認為，去除了細胞壁的植物體細胞在作物的改良中有著重要的意義，它是外源遺傳物質的良好受體，能夠吸附或攝入外源的細胞器、脂質體、質粒、分子片段等。從這種細胞的原生質體再生完整植株是其高效應用于遺傳工程的關鍵（注：劉大鈞：《向小麥轉移外源抗病性回顧與展望》?！赌暇┺r業(yè)大學學報》，1994年，第17期，第1—7頁。）。劉大鈞看準這一點，先后派出吳琴生和楊世湖兩位優(yōu)秀學生和得力助手去英、美學習小麥、水稻原生質體培養(yǎng)與利用的技術，派到當時國際上公認最有水平實驗室，因此，劉大鈞帶領的科研團隊在原生質體的培養(yǎng)上亦很快走在國際先進水平的前列。據陳佩度回憶，“吳琴生在英國洛桑試驗站搞小麥的原生質體培養(yǎng)，他是在國際上最早拿到了綠芽的。楊世湖是最早拿到秈稻原生質體成苗的，可以說他們做出來的都是國際一流水平?！痹趩柕絽乔偕淌跁r，他謙虛地說到：“這都是得益于劉先生的英明決策啊，當時學校的第一個863項目就是在劉先生的帶領下做小麥的原生質體培養(yǎng)和細胞融合，也就是那時候為后來打下了基礎。”

1986年3月，面對世界高技術蓬勃發(fā)展、國際競爭日趨激烈的嚴峻挑戰(zhàn)，王大珩、王淦昌、楊嘉墀和陳芳允4位科學家提出“關于跟蹤研究外國戰(zhàn)略性高技術發(fā)展的建議”。在這份報告中，他們針對世界高科技迅速發(fā)展的緊迫現(xiàn)實，向中共中央提出了建議和設想：要全面追蹤世界高技術的發(fā)展，制定中國高科技的發(fā)展計劃。這份報告很快得到鄧小平的批示，他認為這個建議十分重要，并指示“找些專家和有關負責同志討論，提出意見，以憑決策”，并認為“此事宜速作決斷，不可拖延”。在充分論證的基礎上，黨中央、國務院果斷決策，于1986年11月正式啟動實施了高技術研究發(fā)展計劃，簡稱“863計劃”，旨在提高中國自主創(chuàng)新能力，堅持戰(zhàn)略性、前沿性和前瞻性，以前沿技術研究發(fā)展為重點，統(tǒng)籌部署高技術的集成應用和產業(yè)化示范，充分發(fā)揮高技術引領未來發(fā)展的先導作用。

圖7-4　1986年劉大鈞（左二）訪問英國洛桑試驗站，看望吳琴生（左一）、翟虎渠（右一）

此時，作為國內植物細胞遺傳學領頭人的劉大鈞，敏銳地感到了國家對高新科研的重視。恰逢吳琴生在英國訪學，對西方的高新技術有一定的了解，當即決定要拿下“863”項目。吳琴生按計劃是1987年7月回國，劉大鈞再三囑托一定要按時回來，因為項目申報聽證會就在8月?？釤岬氖锥?，和往常一樣到處散發(fā)著熱氣，劉大鈞和吳琴生在北京會合了。經過商討，劉大鈞決定以吳琴生的名義申報這個項目，因為自己畢竟身為校長，對分子遺傳方面的前沿知識也沒有吳琴生了解。吳琴生一開始很不情愿，覺得自己不能搶在老師前頭，但這也是劉大鈞過人的地方，該退居二線時絕不“奮勇爭先”。在劉大鈞的支持和鼓勵下，吳琴生申請了“小麥原生質體培養(yǎng)、細胞融合和植株再生”項目。這樣的組合——先進的生物技術加上雄厚的科研實驗條件，征服了各位評審的專家，吳琴生、劉大鈞很順利地拿下了這個項目。數十萬元的科研經費，讓吳琴生這個剛剛學成回國的海歸，一下有了可以學以致用的地方。

據吳教授講，1985年的時候，劉大鈞把他送到英國洛桑試驗站去作訪問學者，學習生物技術。當時送到英國，也是經過劉大鈞深思熟慮的。當時很多人都去美國，但是劉大鈞覺得英國的生物技術在世界上也是領先的，既然大家都去美國學習，那就學不到獨特的先進技術了，所以就把他派到了英國。在此之前，劉大鈞還讓吳琴生隨學校農業(yè)考察團，去了一趟澳大利亞，對澳大利亞的生物技術研究進展也有所了解（注：吳琴生訪談，2013年5月17日，南京。資料存于采集工程數據庫。）。吳琴生教授去英國訪學3年，帶回了英國最先進的生物技術。隨之，劉大鈞的分子遺傳研究室生物技術研究力量得到進一步加強。(123shoppingwar.com)對多花黑麥草的研究

20世紀80年代以來，禾谷類植物的原生質體培養(yǎng)和植株再生研究發(fā)展很快。自Vasil（1980年）首先從珍珠栗原生質體培養(yǎng)獲得小植株后，各路研究人員又從羊草、象草和甘蔗原生質體培養(yǎng)出再生苗，粳稻、棒頭草、玉米和普通小麥等原生質體培養(yǎng)亦相繼再生成苗。劉大鈞在與陳佩度、吳琴生等人商量后，將研究目標轉向多花黑麥草（Annual Ryegrass，學名：Lolium multifolorum）。多花黑麥草是重要的禾本科牧草，具有蛋白質含量高，抗禾谷類多種病害等特點，在我國華中、華東、華南地區(qū)均有分布，研究多花黑麥草的原生質體的分離培養(yǎng)和再生植株對禾谷類作物和牧草的基因工程及細胞融合研究都有重要意義。原生質體培養(yǎng)的研究，不僅是生命活動理論研究一個良好的載體，對改良作物的某些性狀，潛力巨大。

1989年，在團隊的共同努力下，通過多花黑麥草幼穗培養(yǎng)獲得5個品種的細胞懸浮培養(yǎng)系，其中1個培養(yǎng)系顆粒較粗，具有分化能力，但是原生質體得率很低，另外3個品種的細胞系雖然細胞團非常細小，生長速度也很快，但分化能力很低，只有品種Multimo產生的細胞系不但含有很細小的細胞團而且有結構致密、體積較大的細胞團，這個細胞系既具有分化能力，原生質體得率又達到實驗要求。在劉大鈞、吳琴生指導下，陳文品等人通過研究還發(fā)現(xiàn)，原生質體培養(yǎng)的結果除了與培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和原生質體密度有關外，還與用作游離原生質體的懸浮細胞的生長狀態(tài)有關。每次繼代培養(yǎng)時的接種量和繼代培養(yǎng)間隔時間（3~6天）是懸浮細胞保持良好生長狀態(tài)的重要因素。劉大鈞、吳琴生、陳文品等通過實驗比較了3種不同的原生質體培養(yǎng)方法，發(fā)現(xiàn)用看護培養(yǎng)植板率最高，用瓊脂糖固體平板培養(yǎng)方法比較簡單，也可以獲得比液體淺層培養(yǎng)高的植板率。這個結果和陳東方、夏振傲（1987年）在榜頭草原生質體培養(yǎng)中的結果是一致的。關于原生質體培養(yǎng)基中的氮素營養(yǎng)，他們得到的結論是：將MS培養(yǎng)基中的氨和硝酸鹽全部去掉，只用谷氨酰胺作為氮源可以取得較好的結果。同時實驗結果也表明，用有機態(tài)氮代替氨態(tài)氮和硝態(tài)氮能得到較高的原生質體植板率，在多花黑麥草培養(yǎng)基中加入葡萄糖可以有效地提高原生質體植板率，這與在粳稻、榜頭草、普通小麥中的實驗結果相似。1982年，Joneg和Dale將多花黑麥草原生質體培養(yǎng)成愈傷組織。1988年，Dalton從原生質體再生的愈傷組織上分化出綠苗和白苗。劉大鈞團隊的實驗也在1990年從多花黑麥草原生質體培養(yǎng)分化出白苗。禾本科植物在花藥培養(yǎng)中出現(xiàn)白化苗是一個普通現(xiàn)象，在原生質體培養(yǎng)中出現(xiàn)白化苗也屢有報道。多花黑麥草在體細胞培養(yǎng)時就易出現(xiàn)白化苗，并且隨著繼代培養(yǎng)次數的增加白苗頻率隨之增高。因此，劉大鈞團隊認為白化苗現(xiàn)象可能會成為多花黑麥草原生質體培養(yǎng)成植株的主要障礙，對于其發(fā)生的原因及控制辦法，有待作進一步探討。

創(chuàng)新電融合方法

原生質體電融合法自Senda等提出以后，經Zimmermann等的改進與發(fā)展，已經成為植物體細胞雜交的一個重要手段。原生質體融合為有性不親和種屬間的核基因及胞質基因的轉移與重組提供了機會，對作物新品種的培育具有重要意義。小麥細胞融合的研究開展較晚，但隨著小麥原生質體培養(yǎng)及植株再生技術的突破，已使細胞融合研究提上了日程。

到1990年，劉大鈞團隊按既定目標，在小麥、黑麥草原生質體培養(yǎng)的基礎上，對如何提高原生質體分裂和植株再生頻率、原生質體融合的方法與條件以及結合細胞融合儀的研制進行了系統(tǒng)的研究，完成了小麥原生質體再生植株，同時他們還成功研制出南農CY-1型細胞電融合儀。南農CY-1型細胞電融合儀是劉大鈞組織了從事原生質體培養(yǎng)和融合研究的吳琴生以及從南京大學物理系畢業(yè)來南農工作、很有理論基礎的姚國順、周靜嫻夫婦一起研究成功的。經過一系列的實驗表明，南農CY-1型細胞融合儀的性能已經達到各類生物細胞融合所要求的指標，可廣泛應用于植物、微生物、動物等細胞融合的研究，而且該儀器有較高的性價比，可作為細胞融合的有效工具。南農CY-1型細胞融合儀后來通過江蘇省科委的技術成果鑒定，達到國內先進水平，不僅為自己實驗室，還為國內相關單位實驗室開展類似研究創(chuàng)造了條件（注：DA-020-002，《小麥原生質體培養(yǎng)、高效成株及細胞融合技術的最終研究報告》。存于南京農業(yè)大學檔案館。）。

在電融合技術支持下，劉大鈞團隊在1990年首次報道了普通小麥與多年生黑麥草間原生質體的電融合，采用碘乙酰胺處理小麥原生質體，并通過同工酶和限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP），證明獲得小麥與黑麥草體細胞雜種再生愈傷組織（注：DA-020-002，《小麥原生質體培養(yǎng)、高效成株及細胞融合技術的最終研究報告》。存于南京農業(yè)大學檔案館。）。通過此次實驗還表明小麥與其親緣種屬間可以通過細胞融合轉移種質，擴大有益基因的利用范圍；小麥和多年生黑麥草原生質體經電融合處理后，原生質體能正常分裂和再生愈傷組織，在適宜的電場強度范圍內，用電融合法進行體細胞雜交是有效的。劉大鈞團隊將實驗室所獲得的6個雜種細胞系用ADH同工酶作重復鑒定，在用其他同工酶和RFLP鑒定時，各個細胞系不同程度地顯示了具有全部雙親譜帶（HP6-50）或黑麥草與部分小麥譜帶結合的雜種類型（HP6-16、24、28、47、64）。分析其原因可能是小麥懸浮細胞系的染色體數目和結構在離體培養(yǎng)過程中已發(fā)生較大變化。細胞學研究表明，該小麥細胞系染色體變異范圍在2n=29-58之間，以2n=31為主，偏離正常染色體數（2n=42）。

1991年，劉大鈞、吳琴生團隊發(fā)表了《普通小麥和黑麥草原生質體電融合的適宜條件》論文，該文指出：在同一電場條件下，不同物種原生質體的電融合反應有差異，滲透壓較低的融合液有利于原生質體融合；在適宜的電脈沖處理后，原生質體存活率與對照相似，經融合處理的原生質體培養(yǎng)一個月，其植板率有所提高。在電融合技術支持下，劉大鈞團隊還對葦狀羊茅、大麥以及“中國春”小麥的原生質體培養(yǎng)進行了研究，為其后進一步開展小麥染色體工程研究積累了經驗。