實(shí)驗(yàn)九　氨基轉(zhuǎn)換作用的測定(分光光度法)

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1．了解轉(zhuǎn)氨酶在生物體中的生理功能。

2．掌握測定轉(zhuǎn)氨酶催化氨基轉(zhuǎn)換作用的原理和方法。

【實(shí)驗(yàn)原理】

體內(nèi)氨基酸的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)是由轉(zhuǎn)氨酶催化完成的。轉(zhuǎn)氨酶催化α-氨基酸的α-氨基與α-酮酸的α-酮基之間的相互轉(zhuǎn)化，從而生成一種新的氨基酸與一種新的酮酸，這種作用稱為轉(zhuǎn)氨基作用。它在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、分解等中間代謝過程中，在糖、脂及蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝的相互聯(lián)系、相互制約及相互轉(zhuǎn)變上都起著很重要的作用。

在動(dòng)物機(jī)體中活力最強(qiáng)、分布最廣的轉(zhuǎn)氨酶有兩種:一種為谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱GPT)，另一種為谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(簡稱GOT)。它們的催化反應(yīng)如下:

GOT催化生成的草酰乙酸在檸檬酸苯胺的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楸崤c二氧化碳。由上可見此反應(yīng)最終產(chǎn)物都是丙酮酸。測定單位時(shí)間內(nèi)丙酮酸的產(chǎn)量即可得知轉(zhuǎn)氨酶的活性。丙酮酸可與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)，形成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中顯棕紅色。再與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，計(jì)算出其含量，以此測定轉(zhuǎn)氨酶的活性。轉(zhuǎn)氨酶的活性單位為:每毫升血清與基質(zhì)在37℃下作用60min，生成1μmol丙酮酸為1個(gè)單位。

丙酮酸+2，4-二硝基苯肼→丙酮酸二硝基苯腙(棕紅色)

【藥品試劑】

1．磷酸鹽緩沖液(pH7．4):取甲液825 ml，乙液175 ml，混合，pH值為7．4即可使用。

甲液:1/15 mol/L磷酸氫二鈉溶液:稱取磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄) 9．47 g(或Na₂HPO₄·12H₂O23．87 g)溶于蒸餾水，定容到1000 ml。

乙液:1/15 mol/L磷酸二氫鉀溶液:稱取磷酸二氫鉀(KH₂PO₄) 9．078 g，溶于蒸餾水，定容至1000 ml。

2．GPT基質(zhì)液:稱取α-酮戊二酸29．2 mg及DL-丙氨酸1．78 g，溶于pH7．4的磷酸鹽緩沖液20 ml中，溶解后再加緩沖液70 ml，并移入100 ml容量瓶內(nèi)。加1 mol/L的NaOH溶液0．5 ml，校正pH值至7．4。再用pH7．4磷酸緩沖液定容到100 ml。4℃可保存一周。

3．GOT基質(zhì)液:稱取α-酮戊二酸29．2 mg及DL–天冬氨酸2．66 g，溶于pH7．4的磷酸鹽緩沖液20 ml中，溶解后再加緩沖液70 ml，并移入100 ml容量瓶內(nèi)。加1 mol/L的NaOH溶液0．5 ml，校正pH值至7．4。再以pH7．4的磷酸緩沖液定容到100 ml。4℃可保存一周。

4．2，4-二硝基苯肼溶液:稱取2，4-二硝基苯肼20 mg，先溶于10 ml濃鹽酸中(可加熱助溶)，再以蒸餾水稀釋至100 ml(有沉渣可過濾)，棕色瓶內(nèi)保存。

5．丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2μmol/mL):精確稱取丙酮酸鈉22 mg，溶解后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，用磷酸緩沖液(1/15 mol/L，pH7．4)稀釋至刻度。

6．0．4 mol/L氫氧化鈉溶液。

7．血清。

8．檸檬酸苯胺溶液:取檸檬酸50 g溶于50 ml蒸餾水中，再加苯胺50 ml充分混合即成，低溫出現(xiàn)結(jié)晶時(shí)，可置于37℃水浴中，待溶解后使用。

【實(shí)驗(yàn)方法】

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:取6支試管按表5-12操作。

表5-12　　　　　　　丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線的制備

混勻后，在520 nm波長處，以空白調(diào)“0”點(diǎn)，讀取各管光密度。以單位值為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．GPT(GOT)測定:取2支潔凈的試管按表5-13操作。

表5-13　　　　　　　血清GTP活性測定

GPT測定不加檸檬酸苯胺溶液，其他操作方法同GOT測定法。

3．實(shí)驗(yàn)結(jié)果及計(jì)算:由所測得測定管之光密度值直接查丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得丙酮酸的μmol數(shù)(用1μmol丙酮酸代表1．0單位酶活力)，計(jì)算100ml血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性單位。

【思考題】

1．轉(zhuǎn)氨酶在物質(zhì)代謝過程中有什么重要作用?

2．血清轉(zhuǎn)氨酶活性測定有什么意義?