項(xiàng)目一　比色分析法和分光光度法

許多物質(zhì)本身具有一定的顏色，也有許多物質(zhì)本身無(wú)顏色，在加入適當(dāng)?shù)娘@色劑后才生成有色物質(zhì)。溶液濃度越大，顏色越深。因此，可以利用比較溶液顏色深淺的方法來(lái)測(cè)定有色溶液的濃度。

一、基本原理

比色分析法是依據(jù)比較溶液顏色深淺來(lái)測(cè)定有色溶液的濃度，并用各種光電比色計(jì)及分光光度計(jì)完成測(cè)定分析的方法，其理論基礎(chǔ)符合朗伯－比爾（Lambert－Beer）定律。

二、相關(guān)基本概念

1.物質(zhì)的顏色和波長(zhǎng)（λ）

可見(jiàn)光：λ＝400～760nm。

紫外光：λ＜400nm。

紅外光：λ＞760nm。

各種顏色光的近似波長(zhǎng)列于表2－1。

表2－1　各種顏色光的近似波長(zhǎng)

2.單色光

白光通過(guò)棱鏡后可分解成各種波長(zhǎng)不同的色光。具有一種波長(zhǎng)且不能再分解的光稱(chēng)為單色光。

3.光的互補(bǔ)

將兩種適當(dāng)顏色的可見(jiàn)光按一定強(qiáng)度比例混合可得到白光，這兩種光稱(chēng)為互補(bǔ)光，該現(xiàn)象稱(chēng)為光的互補(bǔ)。各色光的互補(bǔ)關(guān)系見(jiàn)圖2－1。

圖2－1　各色光的互補(bǔ)關(guān)系示意圖

4.溶液的顏色和光吸收的關(guān)系

（1）溶液的顏色是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與該溶液主要吸收的光互補(bǔ)的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。

例如：一束白光通過(guò)核黃素溶液，溶液呈黃色。因?yàn)樗{(lán)色光被吸收，而其他顏色的光均為兩兩互補(bǔ)，透過(guò)光只多余出黃色光，所以核黃素溶液呈黃色。

（2）光吸收曲線(xiàn)：測(cè)定同一物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光線(xiàn)的吸收程度，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)、光密度為縱坐標(biāo)作圖，所得曲線(xiàn)為光吸收曲線(xiàn)。

5.物質(zhì)濃度、液層厚度與光吸收的關(guān)系（Lambert－Beer定律）

當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液后，光被溶液吸收的程度（D）與溶液的濃度（C）、液層的厚度（L）以及入射光的強(qiáng)度（I₀）有關(guān)。溶液濃度越大，液層越厚，吸收的光就越多，這就是物質(zhì)（均勻透明固體、液體、氣體）對(duì)光的吸收定律，即朗伯－比爾（Lambert－Beer）定律。

公式D＝KCL

式中：K為消光系數(shù)，K＝D/CL，表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時(shí)的吸光度。同一溶質(zhì)，K值相同。

意義：物質(zhì)對(duì)光吸收的程度與該物質(zhì)的消光系數(shù)K、溶液濃度C、液層厚度L呈正比。

根據(jù)上述公式可推導(dǎo)出對(duì)待測(cè)溶液濃度的計(jì)算。

（1）標(biāo)準(zhǔn)管法：在同樣條件下，先測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)液的光密度（D）值，然后計(jì)算。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法：分析大批待測(cè)樣品時(shí)，采用此法較方便。先配制一系列濃度由小到大的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)出它們的光密度（D）值。在一定濃度范圍內(nèi)，溶液濃度（C）與其光密度（D）之間呈直線(xiàn)關(guān)系。以各管D值為縱坐標(biāo)，C值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。待測(cè)溶液D值測(cè)出后，在曲線(xiàn)上查出C值。

（3）標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)法：得到多次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的光密度后求出平均值，標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)＝標(biāo)準(zhǔn)液濃度/標(biāo)準(zhǔn)液平均光密度。同法測(cè)出待測(cè)液的光密度，代入下式：

C＝待測(cè)溶液光密度×標(biāo)準(zhǔn)系數(shù)

（4）消光系數(shù)法：在1%濃度、1cm厚度的溶液中測(cè)得K＝E1cm 1%，或1克分子濃度、1cm厚度溶液中測(cè)得K＝ξ。

常用于紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)、核酸含量，二者分別在280nm和260nm處有最大吸收，其消光系數(shù)可查表得到。在同樣條件下，測(cè)定待測(cè)溶液的光密度，帶入上式即可求得C。

優(yōu)點(diǎn)：可直接測(cè)定，不需呈色反應(yīng)，不損失樣品，操作簡(jiǎn)便。

注意事項(xiàng)：選擇1cm石英比色杯（玻璃杯在紫外光區(qū)會(huì)強(qiáng)烈吸收紫外光，不能使用）。

三、比色分析條件的選擇

1.波長(zhǎng)的選擇

原則為“吸收最大，干擾最小”。

例：A、B兩種物質(zhì)，A物質(zhì)最大吸收峰在a處，B物質(zhì)在a處也有吸收，對(duì)A物質(zhì)的測(cè)定有干擾，故選a處波長(zhǎng)進(jìn)行比色測(cè)定以滿(mǎn)足以上原則。

2.光密度的選擇

D值讀數(shù)在檢流計(jì)標(biāo)尺中部時(shí)準(zhǔn)確度較高，相對(duì)誤差最小。一般D＝0.05～1。

3.顯色條件的選擇

在比色分析中常需要利用空白溶液將儀器的透光率調(diào)節(jié)為100%，此時(shí)D為0?？瞻兹芤簝H僅不含被測(cè)物質(zhì)，而其他溶液、試劑和處理?xiàng)l件與被測(cè)溶液完全相同。因此，利用空白溶液可消除顯色溶液中其他有色物質(zhì)的干擾，抵消比色杯和試劑對(duì)入射光的影響。

四、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

光度計(jì)、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)（圖2－2）都由光源、單色光器、狹縫、吸收杯和檢測(cè)器系統(tǒng)等部分組成。

圖2－2　光度計(jì)、分光光度計(jì)的基本結(jié)構(gòu)

（一）光源

一個(gè)良好的光源要求具備發(fā)光強(qiáng)度高、光亮穩(wěn)定、光譜范圍廣和使用壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)。鎢燈適用于做波長(zhǎng)在340～900nm之間的光源。更先進(jìn)的分光光度計(jì)外加有穩(wěn)壓調(diào)控的氫燈（hydrogen lamp）。它適用于做波長(zhǎng)為200～360nm的紫外分光分析的光源。

（二）單色光器

分光光度法測(cè)定某一物質(zhì)的光密度需要在某一特定波長(zhǎng)下進(jìn)行。單色光器的作用在于根據(jù)需要選擇一定波長(zhǎng)范圍的單色光。在實(shí)際工作中欲選擇出單個(gè)某波長(zhǎng)的光線(xiàn)是困難的。所謂單色光是指在此波長(zhǎng)有最大發(fā)射，而在相鄰較長(zhǎng)和較短波長(zhǎng)范圍內(nèi)的發(fā)射能量相對(duì)較少。單色光的波長(zhǎng)范圍愈窄，儀器的敏感度愈高，測(cè)量的結(jié)果愈可靠。

（三）狹縫

通過(guò)單色光器的發(fā)射光的強(qiáng)度可能過(guò)強(qiáng)也可能過(guò)弱而不利于進(jìn)一步檢測(cè)。狹縫是由一對(duì)隔板在光通路上形成的。通過(guò)調(diào)節(jié)狹縫的大小來(lái)調(diào)節(jié)入射單色光強(qiáng)度并使入射光形成平行光線(xiàn)，以適應(yīng)檢測(cè)器的需要。光電比色計(jì)的狹縫是固定的，而光度計(jì)和分光光度計(jì)的狹縫大小是可調(diào)的。

（四）吸收杯

吸收杯又稱(chēng)為樣品杯（sample cell），是光度測(cè)量系統(tǒng)的最重要部分之一。在可見(jiàn)光范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)選用光學(xué)玻璃吸收杯，在紫外線(xiàn)范圍內(nèi)測(cè)量時(shí)要選用石英吸收杯。

（五）檢測(cè)器系統(tǒng)

硒光電池、光電管或光電倍增管等光電元件常用來(lái)作為受光器，它們能將通過(guò)吸收杯的光線(xiàn)（I）的能量轉(zhuǎn)變成電能。進(jìn)一步再用適當(dāng)?shù)姆椒y(cè)量所產(chǎn)生的電流。

光電比色計(jì)用硒光電池為受光器。由于硒光電池的光敏感性低，故它不能檢出強(qiáng)度非常弱的光線(xiàn)。并且，對(duì)波長(zhǎng)在270nm以下和700nm以上的光波不敏感。

較精密的分光光度計(jì)都是采用真空光電管或光電倍增管作為受光器的，并采用放大裝置以提高敏感度。雖然光譜范圍狹窄的單色光的能量比范圍寬的弱很多，但這種有放大線(xiàn)路的靈敏檢測(cè)系統(tǒng)仍可能將其準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)。

五、幾種常用的國(guó)產(chǎn)分光光度計(jì)

（一）可見(jiàn)光分光光度計(jì)

1.721型分光光度計(jì)

721型分光光度計(jì)是一種采用光電管為受光器的較高級(jí)的可見(jiàn)光分光光度計(jì)。由穩(wěn)壓電源供電的光源燈發(fā)出穩(wěn)定的白光。光線(xiàn)經(jīng)反射鏡投入狹縫，再經(jīng)準(zhǔn)直鏡反射進(jìn)入棱鏡，在棱鏡中發(fā)生色散后，光線(xiàn)再經(jīng)鋁面反射，其中一部分經(jīng)原路返回，并穿過(guò)狹縫，透過(guò)反射鏡進(jìn)入吸收杯。從吸收杯射出的光線(xiàn)再經(jīng)光門(mén)射到光電管上，產(chǎn)生相應(yīng)的電流，并經(jīng)電流表指示出相應(yīng)的刻度值。

操作方法如下。

（1）靈敏度選擇鈕放在“1”擋（如調(diào)不到“0”時(shí)，再選用較高的擋）。

（2）轉(zhuǎn)動(dòng)波長(zhǎng)選擇鈕，選用所需的波長(zhǎng)。

（3）接通電源（指示燈亮）。

（4）揭開(kāi)比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“0”位鈕，使電表指針對(duì)準(zhǔn)T＝0處。

（5）將比色杯放入比色杯架上，使空白管對(duì)向光路，蓋好比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“百位鈕”調(diào)準(zhǔn)電表指針使之指向D＝0（T＝100處）。

（6）拉動(dòng)比色皿座的拉桿，使測(cè)定杯進(jìn)入光路，迅速?gòu)碾姳砩献x出光密度值，記錄。比色完畢后，關(guān)上電源開(kāi)關(guān)，取出比色杯，將比色皿暗箱蓋蓋好，清洗比色皿并控干。

2.722型分光光度計(jì)的使用

（1）選擇波長(zhǎng)。

（2）裝液：①裝入液體2/3～3/4杯，不可過(guò)多或過(guò)少；②用擦鏡紙擦干外表面液體。

（3）靈敏度：調(diào)整后不再動(dòng)。

（4）將比色杯放入比色杯架上，使空白管對(duì)向光路，蓋好比色皿暗箱蓋，轉(zhuǎn)動(dòng)“百位鈕”調(diào)準(zhǔn)電表指針使之指向D＝0（T＝100處）。原則：開(kāi)蓋調(diào)“T＝0”，關(guān)蓋調(diào)“T＝100”。

（5）拉動(dòng)比色皿座的拉桿，使測(cè)定杯進(jìn)入光路，迅速?gòu)碾姳砩献x出光密度值，記錄。比色完畢后，關(guān)上電源開(kāi)關(guān)，取出比色杯，將比色皿暗箱蓋蓋好，清洗比色皿并控干。

（二）紫外分光光度計(jì)

UV－754型分光光度計(jì)是一種可供在紫外到紅外區(qū)（200～1000nm）測(cè)量吸收光譜的較高級(jí)分光光度計(jì)。此儀器的光學(xué)部分與721型分光光度計(jì)相類(lèi)似，但它采用石英棱鏡作單色光器，有鎢絲燈和氫弧燈兩種光源。UV－754型分光光度計(jì)的電學(xué)部分較為復(fù)雜。光電流經(jīng)過(guò)放大線(xiàn)路加以放大后，得到的樣品信號(hào)變?yōu)榕c透光率呈比例的值。

操作方法如下。

1.測(cè)試準(zhǔn)備

（1）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)之前，檢查一下試樣室是否放置遮光物。

（2）試樣槽置于“參考”位置。

（3）接電源開(kāi)關(guān)（如果工作波長(zhǎng)在200～360nm時(shí)需按氘燈觸發(fā)按鈕）。顯示器顯示“754”后，數(shù)值即清晰顯示出來(lái)。若顯示為100.0，則表示儀器已通過(guò)自檢程序。

（4）儀器預(yù)熱30min后開(kāi)始測(cè)試。

2.測(cè)試

（1）數(shù)值顯示為100.0后，穩(wěn)定2～3s，即可把試樣槽置于“樣品”位置進(jìn)行測(cè)試。待第一個(gè)數(shù)據(jù)打印完畢后，再可將試樣槽置于第二個(gè)“樣品”位置測(cè)試。

（2）每當(dāng)需要調(diào)換波長(zhǎng)時(shí)，必須把試樣槽置于“參考”位置，重新調(diào)滿(mǎn)度。

3.注意事項(xiàng)

（1）光電比色計(jì)屬于精密儀器，應(yīng)精心愛(ài)護(hù)使用，要防震、防潮、防腐蝕。

（2）儀器預(yù)熱30min后開(kāi)始測(cè)試。光能量變化急劇，使光電管受光后響應(yīng)緩慢，需一段光響應(yīng)平衡時(shí)間。

（3）比色杯的好壞對(duì)光密度讀數(shù)的影響很大，要保持比色杯的清潔干凈，保護(hù)光學(xué)面的透明度，不能手握光學(xué)面，也不能用粗糙的物體接觸光學(xué)面，比色杯中的液體應(yīng)適量，不應(yīng)過(guò)滿(mǎn)，比色杯外壁的液體應(yīng)用擦鏡紙擦干，以防腐蝕儀器和影響讀數(shù)。如比色液為強(qiáng)酸、強(qiáng)堿，應(yīng)盡快比色，以防破壞比色杯。

（4）比色時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以防光電系統(tǒng)疲勞。如需連續(xù)使用，中間應(yīng)適當(dāng)暫停一下，使之避光休息。