自動生化分析儀的應(yīng)用不僅是操作方法的變化,而且由于引進一系列高精技術(shù),所用的方法測定原理都有迅速的發(fā)展。目前自動生化分析儀的分析方法主要有終點法(平衡法)、連續(xù)檢測法(動態(tài)法)和固定時間法(兩點法)等。

(一)終點法

1.終點法的特點 被測物質(zhì)在反應(yīng)過程中完全被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物,即達到反應(yīng)終點,根據(jù)終點吸光度的大小求出被測物濃度,稱為終點法。但實際上被測物并沒有完全被轉(zhuǎn)化,而是與產(chǎn)物達到一個動態(tài)的化學平衡,故又稱平衡法。終點法的優(yōu)點是參數(shù)設(shè)置簡單,精密度較好。缺點是反應(yīng)時間一般較長,不適用于離心式自動分析儀。

終點時間的確定首先要根據(jù)時間-吸光度曲線,如Trinder反應(yīng)測定尿酸,反應(yīng)曲線上3~ 5min其吸光度已趨向穩(wěn)定,可將5min作為反應(yīng)終點;其次要結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況,如溴甲酚綠法測定血清清蛋白,清蛋白與溴甲酚綠在10s內(nèi)很快完成反應(yīng),之后α球蛋白和β球蛋白與溴甲酚綠發(fā)生“慢反應(yīng)”,使反應(yīng)曲線上的吸光度在10s后仍繼續(xù)緩慢上升,持續(xù)約達10min,因此終點時間應(yīng)采用10~30s,而不選擇10min。

2.終點法的分類 可分為一點終點法和兩點終點法。

(1)一點終點法:反應(yīng)到達終點,在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時選擇一個終點吸光度值,又稱一點終點法。常用于鈣、磷、鎂、葡萄糖、總膽固醇、三酰甘油等測定等。計算公式:待測物濃度C U=(待測吸光度A U-試劑空白吸光度A B)×K,K為校準系數(shù)。

(2)兩點終點法:在被測物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開始時,選擇第一個吸光度(A 1),當反應(yīng)到達終點或平衡時選擇第二個吸光度(A 2),兩點吸光度之差用于計算結(jié)果,稱為兩點終點法,能有效消除溶血、黃疸和脂濁等標本光吸收造成的干擾。如總膽紅素(氧化法或重氮法)、結(jié)合膽紅素(氧化法或重氮法)、血清總蛋白(雙縮脲法)、血清清蛋白(溴甲酚氯法)、總膽汁酸測定等。計算公式:待測物濃度C U=(待測吸光度A 2-待測吸光度A 1)×K。

(二)連續(xù)監(jiān)測法

連續(xù)監(jiān)測法又稱速率法。是在測定酶活性或用酶法測定代謝產(chǎn)物時,連續(xù)選取時間-吸光度曲線中線性期的吸光度值,并以此線性期的單位吸光度變化值(ΔA/min)計算結(jié)果。所謂線性期就是各點吸光度差值相等,該期對底物來說屬零級反應(yīng)。優(yōu)點是能確定線性期,速度快、準確性高。

該法常用于酶活性測定,如谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、淀粉酶和肌酸激酶等。

(三)固定時間法

又稱兩點法,指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點,既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度,兩點吸光度的差值用于結(jié)果計算,稱為固定時間法,其計算公式與兩點終點法相同,為待測物濃度C U=(待測吸光度A 2-待測吸光度A 1)×K。

該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問題。如苦味酸法測定肌酐,反應(yīng)的最初30s內(nèi),血清中快反應(yīng)干擾物(如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等)能與堿性苦味酸反應(yīng);在第二個30s時堿性苦味酸主要與肌酐反應(yīng),且此段時間-吸光度曲線的線性較好(故也可用連續(xù)監(jiān)測法測定肌酐);在80~120s及其以后,堿性苦味酸可與蛋白質(zhì)及其他慢反應(yīng)干擾物反應(yīng)。選用反應(yīng)的第二個30s為測定時間,既避免了快反應(yīng)物質(zhì)的干擾,也避免了慢反應(yīng)物質(zhì)的影響,使肌酐濃度與吸光度變化呈良好的線性關(guān)系,有利于提高分析的特異性和準確度。

透射比濁分析和均相酶免疫分析法是近年隨著檢驗技術(shù)、分子生物學和標記技術(shù)的發(fā)展,應(yīng)用于生化自動分析儀測定的新方法。