實(shí)驗(yàn)六　血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定（賴氏法）

【教學(xué)目標(biāo)】

了解賴氏法測定血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的基本原理，掌握血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的實(shí)驗(yàn)方法及臨床意義。

【實(shí)驗(yàn)原理】

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化丙氨酸與α－酮戊二酸間的氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，生成丙酮酸和谷氨酸。

生成的丙酮酸再與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙。后者在堿性條件下呈紅棕色。其顏色深淺與酶活性呈正比，與同樣處理的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液比色即可測得血清ALT的活性。

【試劑】

（1）0．1mol/L磷酸二氫鉀溶液：稱取KH₂PO₄13．61g，溶解于蒸餾水中，并用蒸餾水定容至1L，于4℃條件下保存。

（2）0．1mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱取Na₂HPO₄14．22g，溶解于蒸餾水中，并用蒸餾水定容至1L，于4℃條件下保存。

（3）0．1mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7．4）：取420mL 0．1mol/L磷酸氫二鈉溶液與80mL 0．1mol/L磷酸二氫鉀溶液混勻。加三氯甲烷數(shù)滴，于4℃條件下保存。

（4）ALT底物緩沖液：精確稱取D－L－丙氨酸1．79g和α－酮戊二酸29．2mg，先溶于0．1mol/L的磷酸鹽緩沖液約50mL中，再用1．0mol/L的NaOH調(diào)pH值至7．4，再加磷酸鹽緩沖液至100mL，配制成200mmol/L丙氨酸與2．0mmol/Lα－酮戊二酸底物緩沖液，4～6℃保存，可穩(wěn)定兩周。每升底物緩沖液可加入麝香草酚0．9g或加三氯甲烷防腐，于4℃條件下保存。

（5）1．0mmol/L 2，4－二硝基苯肼溶液：稱取2，4－二硝基苯肼（分析純）19．8g，溶于1．0mol/L的100mL鹽酸中，室溫，保存于棕色瓶內(nèi)。如有結(jié)晶析出，需重新配制。

（6）0．4mol/L的NaOH溶液：準(zhǔn)確稱取NaOH 1．6g溶解于蒸餾水中，并繼續(xù)加蒸餾水定容至100mL，置于塑料瓶內(nèi)，室溫下可長期保存。

（7）2．0mmol/L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取丙酮酸鈉（分析純）22．0mg，用少量0．05mol/L硫酸溶解并定容至100mL，此液應(yīng)新鮮配制。

【器材】

試管、試管架、吸管、加樣器、恒溫水浴箱、721型分光光度計。

【操作】

取試管三支，按實(shí)驗(yàn)表6－1操作。

實(shí)驗(yàn)表6－1　血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（賴氏法）測定操作步驟

各管混勻，置于37℃恒溫水浴箱中20min，分別加入NaOH溶液（0．4mol/L）5 mL；放置3～5min后以空白管調(diào)零，在505nm波長下比色，讀取各管吸光度。

【計算】

注：按表操作，標(biāo)準(zhǔn)管中丙酮酸和α－酮戊二酸的量與2，4－二硝基苯肼反應(yīng)所顯顏色相當(dāng)于57個卡門氏單位。

【臨床意義】

參考正常值：5～25個卡門氏單位。

正常情況下，ALT存在于機(jī)體的各種組織中，以肝臟含量最高，而血清中活性最低。當(dāng)肝細(xì)胞壞死細(xì)胞膜破裂或某些原因使細(xì)胞膜通透性增加時，酶大量釋放入血，血清中ALT活性明顯升高，所以在臨床上測定此酶的活性有助于肝病的診斷，也可作為觀察療效和預(yù)后的指標(biāo)之一。

【注意事項(xiàng)】

（1）當(dāng)ALT底物液出現(xiàn)混濁時，停止使用。

（2）NaOH加入速度要求一致，避免由于加入速度不一致造成吸光度差異。

（3）使用電器要注意安全。

（4）一支吸管或一個塑料吸頭只能固定移取一種溶液，不能混吸，否則會導(dǎo)致較大誤差。

【思考題】

實(shí)驗(yàn)過程中有兩次置于37℃恒溫水浴箱中，其目的各是什么？其中哪一次保溫對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響最大？

（田　野）