任務(wù)3　微生物的染色方法

1．染色步驟

細(xì)菌染色的基本步驟為：涂片→干燥→固定→染色。

（1）涂片。根據(jù)標(biāo)本性質(zhì)和檢驗(yàn)?zāi)康牟煌科椒ㄒ嗖煌?/p>

一般的方法是：①取一清潔無油脂的載玻片，加一滴生理鹽水（如為液體標(biāo)本或液體培養(yǎng)物可不加鹽水）；②用滅菌的接種環(huán)取菌落（純培養(yǎng)者可取菌苔）少許，與生理鹽水混勻，涂成薄膜，液體培養(yǎng)物可立即挑取菌液涂片。

（2）干燥。一般在室溫中使自然干燥。若需加速干燥，可在火焰上方的熱空氣中加溫干燥，但切勿緊靠火焰，以免標(biāo)本烤焦。

（3）固定。固定的目的包括：使細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)凝固，殺死細(xì)菌；使菌體與玻片黏附牢固；改變菌體對染料的通透性。一般均用加熱法，即將涂片迅速通過火焰2～3次，將玻片反面接觸皮膚，以熱而不燙為宜。

（4）染色。根據(jù)檢驗(yàn)?zāi)康牟煌蛇x用不同的染色方法進(jìn)行染色。滴加染液，以覆蓋標(biāo)本為宜。

（5）媒染。媒染的目的主要為增強(qiáng)菌體與染液間的作用力，其方法根據(jù)各種染色方法而異，有加熱、金屬鹽、碘等。

（6）脫色。目的在于測知染料與被染物之間結(jié)合的牢固程度，方法是將脫色劑（例如酒精和酸等）滴加于經(jīng)過染色的標(biāo)本上，作用一定時間后除去脫色劑。

（7）復(fù)染。目的在于使已脫色的菌體重新染上與前染液顏色呈明顯對比的顏色。

（8）標(biāo)本的保存與封片法。觀察細(xì)菌染色標(biāo)本均用油鏡，如需要保留標(biāo)本，可于觀察后用擦鏡紙沾二甲苯輕輕將鏡油擦去。如需長期保存，最好在標(biāo)本中央加一滴加拿大樹膠，上覆一潔凈蓋玻片，待其自然干燥后，保存于標(biāo)本盒內(nèi)，可多年不變色。

2．染色方法

染色方法包括單染色法和復(fù)染色法兩類。單染色法即只用一種染料對細(xì)菌著色，此法操作簡便，但一般只能顯示菌體的形態(tài)，功能較單一。復(fù)染色法是使用兩種及兩種以上染料對細(xì)菌染色，常用的方法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法等，除了著色及增加反差外，還能對微生物種類作出初步判斷。對于細(xì)菌的一些特殊結(jié)構(gòu)如芽孢、鞭毛等用普通染色方法處理時往往效果很差，難以觀察，應(yīng)采用特殊的方法處理。

1）簡單染色法

簡單染色法是利用單一染料對細(xì)菌進(jìn)行染色的一種方法。此法操作簡便，適用于菌體一般形狀的觀察。常用堿性染料進(jìn)行簡單染色。

簡單染色法常用染液為堿性美藍(lán)染液或石炭酸復(fù)紅染液。操作過程如下：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥（晾干）→鏡檢。涂片、干燥、固定操作見圖2－1，無菌操作過程見圖2－2。

圖2－1　涂片、干燥、固定操作

圖2－2　無菌操作過程

2）鑒別染色法

（1）革蘭氏染色法。

原理：革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中最重要的鑒別染色法，通過此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G＋）和革蘭氏陰性菌（G－）兩大類。一般認(rèn)為革蘭氏陽性菌的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層很薄，類脂質(zhì)含量高，經(jīng)乙醇處理后部分細(xì)胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑變大，經(jīng)脫色劑脫色后，能將結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物洗去，而保留復(fù)染的顏色。

革蘭氏染色所用的四種不同染液和作用介紹如下。

①初染劑（堿性染液）：在堿性溶液中，細(xì)菌細(xì)胞通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷，因此堿性染料的染色部分很容易與細(xì)菌結(jié)合使細(xì)菌著色。經(jīng)染色后的細(xì)菌細(xì)胞與背景形成鮮明對比，在顯微鏡下更易于識別。常用的初染劑為草酸銨結(jié)晶紫染液。

②媒染劑：其作用是增強(qiáng)染料與細(xì)菌的親和力，更好地加強(qiáng)染料與細(xì)胞的結(jié)合。常用的媒染劑是碘液。

③脫色劑：幫助染料從被染色的細(xì)胞中脫色。利用細(xì)菌對染料脫色的難易程度不同，從而對細(xì)菌加以區(qū)分。常用的脫色劑是丙酮或乙醇（一般為95%乙醇）。

④復(fù)染劑：一種堿性染料，目的是使脫色的細(xì)菌重新染上另一種顏色，以便與未脫色細(xì)菌進(jìn)行比較。常用的復(fù)染劑為番紅染液。操作過程（圖2－3）：

需要注意的是脫色是革蘭氏染色中關(guān)鍵的一步，乙醇的濃度、用量、脫色時間及涂片厚度都會影響脫色速度和脫色效果。

結(jié)果：革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。

（2）抗酸性染色法。

抗酸性染色法是鑒別抗酸性桿菌與非抗酸性桿菌的重要方法。

染液：石炭酸復(fù)紅染液、3%鹽酸乙醇溶液、呂氏堿性美藍(lán)溶液。

操作過程：

圖2－3　革蘭氏染色操作

（a）用結(jié)晶紫染色；（b）用自來水沖洗；（c）用碘液媒染；（d）用自來水沖洗；

（e）用95%乙醇脫色；（f）用自來水沖洗；（g）用番紅復(fù)染；（h）用自來水沖洗；（i）吸干水分

結(jié)果：結(jié)核桿菌（抗酸性）染成紅色，其他細(xì)菌（非抗酸性）或細(xì)胞染成藍(lán)色。

3）特殊染色法

（1）芽孢染色法。

原理：芽孢染色法是根據(jù)細(xì)菌的芽孢和菌體對染料的親和力不同，用不同的染料進(jìn)行染色，使芽孢和菌體呈不同顏色而便于區(qū)別。芽孢壁厚，通透性低，著色、脫色較困難，當(dāng)用弱堿性染料在加熱的情況下進(jìn)行染色時，染料可以進(jìn)入菌體及芽孢使其著色，而進(jìn)入芽孢的染料則難以透出。若再復(fù)染（番紅），則菌體呈紅色而芽孢呈綠色。

染液：5%飽和孔雀綠染液、0．5%番紅染液。

操作過程：

挑取菌種進(jìn)行涂片、干燥、固定；取一片小于載玻片的濾紙，將其覆蓋在涂片標(biāo)本上；在濾紙片上滴加孔雀綠染液，用蒸汽加熱5～10min，注意及時補(bǔ)加染液，防止蒸干；取下紙片，待玻片冷卻后水洗；滴加番紅染液復(fù)染30s，水洗，干燥，鏡檢。

結(jié)果：芽孢染色成綠色，菌體染成紅色。

（2）莢膜染色法。

原理：莢膜是包圍在細(xì)菌細(xì)胞外的一層黏液狀或膠質(zhì)狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色，而且可溶于水，易在用水沖洗時被除去，所以觀察莢膜時通常采用負(fù)染色法，即將菌體染色后再使背景著色，從而把莢膜襯托出來。由于莢膜含水量高，制片時通常不用熱固定，以免使莢膜變形影響觀察。

染液：5%黑色素水溶液、番紅染液。

操作過程：

滴一滴黑色素溶液于干凈的載玻片一端，挑取菌種與其混合；另取一干凈的載玻片將此混合物自玻片一端刮至另一端，使之形成一薄層（圖2－4）；自然干燥，輕熱固定；加番紅染液染色30s，水洗，干燥，鏡檢。

圖2－4　涂片及推片方法

結(jié)果：菌體呈紅色，背景呈黑色，莢膜無色。

（3）鞭毛染色法。

原理：細(xì)菌的鞭毛非常纖細(xì)，其直徑為10～12nm，超過了一般光學(xué)顯微鏡的分辨率。因此在染色時，不僅要使鞭毛染色，還要使一部分染料堆積在鞭毛上，加粗鞭毛的直徑，便于在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

鞭毛染色方法很多，但染色成功的關(guān)鍵一是必須使用新鮮培養(yǎng)、運(yùn)動活潑的菌體進(jìn)行染色，二是使用清潔無油的玻片，使菌液流過玻片時能迅速展開，保持細(xì)菌的自然形態(tài)。

染液：A液為單寧酸，F(xiàn)eCl₃，15%甲醛（福爾馬林），1%NaOH溶液，蒸餾水；B液為2%AgNO₃溶液。

操作過程：

①載玻片的清洗。將載玻片在洗衣粉水中煮沸約20min，后用清水充分洗凈，瀝干水后置95%乙醇中，用時取出在火焰上燒去乙醇即可。玻片要求光滑、潔凈，尤其忌用帶油跡的玻片（將水滴在玻片上，無油跡玻片上水能均勻散開）。

②菌種的準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)宜用新培養(yǎng)的菌體，斜面菌種應(yīng)連續(xù)移接3～5次后再使用。

③制片。在清潔的玻片一端滴一滴蒸餾水，用接種環(huán)挑取少量菌體（勿帶出培養(yǎng)基），于水滴中輕蘸幾下（勿涂布），然后將載玻片傾斜，使菌液流至另一端，再放平，自然干燥（勿加熱）。

④染色。滴加鞭毛染色A液染色2～3min，水洗，將殘水瀝干，或用鞭毛染色B液沖去殘水，然后滴加B液，將載玻片稍加熱，染色30～60s，冷卻后水洗。注意：一定要將A液充分洗凈后再加B液。

⑤鏡檢。干燥后用油鏡觀察。

結(jié)果：菌體呈深褐色，鞭毛顯褐色，通常呈波浪形。