實驗十一　酵母菌的雜交試驗

一、實驗?zāi)康?/p>

掌握酵母菌有性雜交育種的基本原理和方法。

二、實驗原理

雜交是在細(xì)胞水平上進(jìn)行的一種遺傳重組方式。有性雜交，一般指不同遺傳型的兩性細(xì)胞間發(fā)生的接合和隨之進(jìn)行的染色體重組，進(jìn)而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。凡能產(chǎn)生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌，原則上都可采用與高等動、植物雜交育種相似的有性雜交方法進(jìn)行育種。

釀酒酵母有其完整的生活史（圖11－1）。從自然界分離到的，或在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的菌株，一般都是雙倍體細(xì)胞，而發(fā)生有性結(jié)合的酵母必須是單倍體，而且要求接合型不同。因此，無論哪種類型的酵母在進(jìn)行有性雜交時，首先必須經(jīng)過單倍體化，即將酵母培養(yǎng)在生孢子培養(yǎng)基中，使其產(chǎn)生子囊，經(jīng)過減數(shù)分裂后，在每一個子囊內(nèi)會形成4個子囊孢子（單倍體），其中2個為a型，2個為α型。獲得單倍體后，需對其接合型進(jìn)行驗證，一般使用標(biāo)準(zhǔn)接合型的單倍體酵母和待測菌株進(jìn)行有性雜交，能和標(biāo)準(zhǔn)的a型酵母進(jìn)行接合的為α型，反之則為a型。為了便于檢測雜交子，一般要求用于實驗的單倍體具有遺傳標(biāo)記。用蒸餾水洗下子囊，用機械法（加硅藻土和石蠟油后在勻漿管中研磨）或酶法（用蝸牛消化酶等處理）破壞子囊，再進(jìn)行離心，然后把獲得的子囊孢子涂布平板，就可以得到由單倍體細(xì)胞組成的菌落。把來自不同親本、不同性別的單倍體細(xì)胞通過離心等方式使之密集地接觸，就有更多機會出現(xiàn)種種雙倍體的有性雜交后代。它們與單倍體細(xì)胞有明顯的差別（見表11－1），易于識別。在這些雙倍體雜交子代中，通過篩選，就可得到優(yōu)良性狀的雜種。

圖11－1　釀酒酵母的生活史

表11－1　釀酒酵母的雙倍體和單倍體細(xì)胞的比較

有性雜交的步驟一般包括：二倍體親本的選擇、單倍體化、接合型驗證、遺傳標(biāo)記制作、有性雜交、雜種的獲得和性能的測定。

本實驗從兩個已知接合型和遺傳標(biāo)記的單倍體酵母為出發(fā)菌，通過有性雜交獲得雜交子。

三、實驗器材

（一）菌種

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）單倍體腺嘌呤缺陷型（ade－）菌株Z1，接合型為a；釀酒酵母單倍體組氨酸缺陷型（his－）菌株Z2，接合型為α。

（二）培養(yǎng)基

（1）完全培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母浸粉1%，葡萄糖2%，瓊脂2%，pH 6．0，117℃滅菌10min。

（2）基本培養(yǎng)基：葡萄糖2%，NaCl 0．1%，K2HPO40．1%，MgSO4·7H2O 0．05%，（NH4）2SO40．5%，處理瓊脂2%，蒸餾水配制，pH 6．0，121℃滅菌15min。

（3）生孢子培養(yǎng)基：麥?zhǔn)吓囵B(yǎng)基。葡萄糖0．1%，KCl 0．18%，酵母浸膏0．25%，CH3COONa 0．82%，瓊脂2%，pH自然。115℃滅菌15min。

（三）實驗器材

試管、離心管、離心機、吸管、培養(yǎng)皿、三角燒瓶、涂布棒等。

四、實驗步驟

（一）單倍體的雜交

（1）取Z1和Z2斜面菌種1環(huán)，分別接種于5mL完全培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)24h。

（2）分別取0．1mL Z1、Z2菌株培養(yǎng)液，混合接種于5mL完全培養(yǎng)基中，置28℃培養(yǎng)6～8h。在顯微鏡下觀察是否形成啞鈴狀接合子，繼續(xù)培養(yǎng)至24h。

（二）雜交子的檢出

將培養(yǎng)物離心（3 500rpm，10min），收集菌體，將菌體用生理鹽水離心洗滌2次，最后懸浮在10mL生理鹽水中。將懸浮液適當(dāng)稀釋，取0．1mL涂布于基本培養(yǎng)基平板上。同時做Z1、Z2菌株的對照平板。將全部平板置28℃培養(yǎng)2～4d，觀察每個平板的菌落生長情況。在基本培養(yǎng)基平板上，Z1和Z2菌株不生長，無菌落長出，而涂布有混合培養(yǎng)物的基本培養(yǎng)基平板上有菌落長出，該菌落可認(rèn)為是雜交子。將其接入完全培養(yǎng)基斜面中保存，待鑒定。

（三）雜交子的驗證

（1）將斜面保存的待測菌株1環(huán)接種于5mL完全培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24h，重復(fù)傳代培養(yǎng)三次。

（2）離心收集菌體，用生理鹽水離心洗滌兩次。將菌泥堆放于生孢子培養(yǎng)基平板上，于22～25℃培養(yǎng)2～4d，觀察子囊孢子形成情況，同時做Z1和Z2菌株生孢子對照。如果待測菌株生孢子，即為雜合二倍體菌株（雜交子）。Z1和Z2菌株不生孢子。

五、實驗記錄

（1）繪制顯微鏡下接合子的形態(tài)。

（2）雜交子的驗證結(jié)果。

六、思考題

（1）如何獲得酵母菌的單倍體孢子？

（2）簡述酵母菌有性雜交的基本過程。

參考文獻(xiàn)

［1］周德慶．微生物學(xué)教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2002．

［2］杜連祥，路福平．微生物學(xué)實驗技術(shù)［M］．北京：中國輕工業(yè)出版社，2011．