實驗二十八　ε－聚賴氨酸生產(chǎn)菌株篩選與發(fā)酵工藝研究

一、實驗目的

學習ε－聚賴氨酸生產(chǎn)菌的篩選方法與發(fā)酵工藝。

二、實驗原理

ε－聚賴氨酸（ε－PL）是一種均聚氨基酸，它是一種新型生物防腐劑，具有強烈的抑菌能力，且安全性能高，可以用于多種食品的保鮮。它是日本酒井平一和島昭二兩位博士在大量篩選有價值的放線菌時發(fā)現(xiàn)的一種新型聚合物。賴氨酸含有兩個氨基，聚合時有α－位和ε－位兩個位點的聚合產(chǎn)物，而ε－位的聚合物具有較強的抑菌能力。ε－聚賴氨酸是含有25～30個賴氨酸殘基的陽離子聚合多肽，當聚合度低于十肽，會喪失抑菌活性。具有高抑菌活性的ε－聚賴氨酸的分子量在3 600～4 300之間。抑菌機理主要表現(xiàn)在破壞微生物的細胞膜結(jié)構(gòu)，引起細胞的物質(zhì)、能量和信息傳遞中斷，最終導致細胞死亡。

圖28－1　ε－多聚賴氨酸結(jié)構(gòu)式

聚賴氨酸抑菌譜廣，在酸性和微酸性環(huán)境中對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果，尤其對其他天然防腐劑不易抑制的革蘭氏陰性的大腸桿菌、沙門氏菌抑菌效果非常好。聚賴氨酸在食品中應用時，多與其他物質(zhì)配合使用，如酒精、有機酸、酯等。聚賴氨酸在食品中多用于肉制品、高鹽食品、快餐、色拉、蛋糕等食品的保鮮，效果較好，具有廣闊應用前景。

三、試劑與器材

（一）菌種

白色鏈霉菌（Streptomyces albus），抑菌實驗鑒定菌：枯草芽孢桿菌。

（二）試劑

無水葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、甲基橙、ε－聚賴氨酸（Sigma公司）、（NH4）2SO4、Na2HP4·12H2O、NaH2PO4·12H2O、MgSO4·12H2O、K2HPO4、KH2PO4。

（三）溶液配制

0．7mmol／L磷酸緩沖液（pH 6．9）：稱取Na2HP4·12H2O 0．260 9g，NaH2PO4· 12H2O 0．109 2g，用少許蒸餾水溶解，定容至1L，調(diào)pH至6．9。

10mmol／L甲基橙試劑：準確稱取甲基橙3．273g，用蒸餾水定容至1L。

聚賴氨酸標準溶液：稱取聚賴氨酸的溴化物10mg，用0．7mmol／L磷酸緩沖液溶解并定容至100mL。

（四）培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖10，蛋白胨2，酵母浸膏5，瓊脂15，pH 6．8，121℃滅菌20min。

種子培養(yǎng)基（貝特納培養(yǎng)基）：葡萄糖5，酵母浸膏5，pH 6．8，121℃滅菌20min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50，酵母浸膏5，（NH4）2SO410，MgSO4·12H2O 0．2，K2HPO48，KH2PO46，pH 6．8，121℃滅菌20min。

（五）實驗儀器

紫外分光光度計、電子分析天平、恒溫培養(yǎng)箱、電熱干燥箱、旋轉(zhuǎn)式搖床、pH計、蒸汽滅菌鍋。

四、實驗步驟

（一）單孢子菌液制備

取一環(huán)菌體接種于斜面培養(yǎng)基上，30℃靜置培養(yǎng)，待孢子成熟后，于斜面上加入無菌生理鹽水10mL，用接種環(huán)刮下孢子，放入含有玻璃珠的150mL三角瓶中，振蕩，打斷孢子鏈，用塞有少量棉花的無菌漏斗過濾，除去菌絲。同時血球計數(shù)板計數(shù)，適當稀釋使孢子濃度為108個／mL。

（二）單菌落培養(yǎng)

吸取以上制備的孢子懸液0．1mL，涂布于裝有15mL斜面培養(yǎng)基的平板上，30℃倒置培養(yǎng)3～4d。

（三）抑菌圈實驗

用2×YT固體培養(yǎng)基倒平板。下層先倒好，等到凝固后，在培養(yǎng)皿下面做上標記。取200μL枯草芽孢桿菌菌液與上層培養(yǎng)基混合，搖勻，使枯草芽孢桿菌均勻分布在培養(yǎng)基內(nèi)。用10mL移液槍移取10mL培養(yǎng)基做上層培養(yǎng)基。凝固后用管碟法將200μL發(fā)酵上清液用移液槍放入牛津杯中，同時用滅過菌的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白，放在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h。當出現(xiàn)邊緣清晰的抑菌圈，利用游標卡尺測定抑菌圈大小。

（四）單菌落保存

挑選抑菌圈較大的菌落轉(zhuǎn)接于保藏斜面，30℃恒溫培養(yǎng)7d，待斜面完全被孢子覆蓋，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（五）搖瓶發(fā)酵

將平板篩選得到的菌株通過搖瓶發(fā)酵測定不同菌株的ε－聚賴氨酸產(chǎn)量，以選育最佳生產(chǎn)菌株。

（1）斜面培養(yǎng)：將4℃保存的斜面菌種，接種至斜面培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)5～7d，至長滿灰色孢子。

（2）種子培養(yǎng)：用接種鏟挑取1cm2菌苔接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃，220r／min，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)48h。

（3）以6%接種量將種子培養(yǎng)液接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中培養(yǎng)，30℃，220r／min，旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)72h。測定細胞干重與產(chǎn)物含量。

（六）生物量測定

將濾紙先在105℃烘箱中烘至恒重，稱重后放入漏斗。取10mL發(fā)酵液，在8 000rpm條件下離心10min，保存上清液，沉淀用無菌水洗滌2次，放入已經(jīng)烘干的濾紙上過濾，將濾紙和菌體在烘箱中烘至恒重，稱量并計算菌體重量。

（七）ε－聚賴氨酸產(chǎn)量測定

（1）用0．7mmol／L磷酸鈉緩沖液（pH 6．9）將聚賴氨酸溶液稀釋成不同濃度（0．05，0．1，0．15，0．2，0．25，0．3，0．35，0．4mg／L）的使用液。

（2）取如上不同濃度的聚賴氨酸溶液2mL與10mmol／L的甲基橙2mL混合，混合液振蕩反應30min，4 000rpm離心15min，取上清液稀釋，以磷酸緩沖液為空白樣，在465nm下測其吸光度A465，繪制標準曲線。

（3）發(fā)酵液離心后取上清液，適當稀釋后，取2mL上清液加入2mL 10mmol／L甲基橙，混合液振蕩反應30min，4 000rpm離心15min，取上清液稀釋。用磷酸緩沖液為空白對照，用分光光度儀在波長465nm下測量吸光度A465。

五、實驗結(jié)果記錄

（1）每個菌株抑菌圈的大小。

（2）每個搖瓶的細胞干重。

（3）ε－聚賴氨酸標準曲線制作時不同濃度的A465，并繪制標準曲線。

（4）產(chǎn)物測定的A465，計算每個搖瓶發(fā)酵的ε－聚賴氨酸產(chǎn)量。

六、思考題

（1）菌懸液制備時為什么要用玻璃珠振蕩？

（2）比較不同菌株的細胞生物量與產(chǎn)物量，兩者之間有沒有相關(guān)性？

參考文獻

［1］陳長華．發(fā)酵工程實驗［M］．北京：高等教育出版社，2009．

［2］姜俊云，賈士儒，董惠鈞，等．攪拌轉(zhuǎn)速和pH對聚賴氨酸發(fā)酵的影響［J］．生物加工過程，2004，2（2）：60—63．