菌種保藏

菌種保藏指微生物純培養(yǎng)的搜集、分類和管理。它兼具活標(biāo)本館、基因庫的作用。

任務(wù)是：

1.廣泛搜集在科學(xué)研究與生產(chǎn)中有價(jià)值的菌和菌株。

2.研究它們的生物學(xué)特性。

3.研究和采取妥善的保藏方法，使菌種不死、不污染并盡可能少發(fā)生變異。

4.編制菌種目錄，為掌握和利用微生物資源提供依據(jù)。

菌種保藏的要點(diǎn)是：

1.選擇適宜的培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和菌齡，以便得到健壯的細(xì)胞或孢子。

2.保存于低溫、隔氧、干燥、避光的環(huán)境中，盡量降低或停止微生物的代謝活動(dòng)，減慢或停止生長繁殖。

3.不被雜菌污染，在較長時(shí)期內(nèi)保持著生活能力。

方法和原理

定期移植法

將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上，在最適溫度中培養(yǎng)，至靜止期或產(chǎn)生成熟的孢子時(shí)，置入5℃的冰箱（或冰庫）保存。在培養(yǎng)和保存的過程中，由于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原菌的生活條件，結(jié)果菌落群體中的個(gè)體就不斷衰老和死亡，因此每5—15天或1—4個(gè)月重新移植一次，具體間隔時(shí)間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設(shè)備，但煩瑣，費(fèi)時(shí)，而且經(jīng)常移植容易引起菌種退化。

礦油封藏法

將化學(xué)純的液體石蠟（礦油）經(jīng)高壓蒸氣滅菌，放在40℃恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分，然后注入斜面培養(yǎng)物中，使液面高出斜面約1厘米。將試管直立，放在15～20℃室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體，既能隔絕空氣，又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥，可以延長菌種保藏的時(shí)間。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶、對(duì)菌種無毒，不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌、芽孢桿菌；不適用于固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、法門氏菌和毛霉目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行，但必須注意防火和污染。

沙土管法

將沙或土過篩、烘干、裝管、滅菌、然后將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻，放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分，干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)，可保存較長時(shí)期。此法適用于芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌、放線菌、鐮刀菌等。

麩皮法

將麩皮制成培養(yǎng)基，培養(yǎng)要保存的菌種，待生長良好后，置干燥器中保存。這是根據(jù)中國釀造酒、醋、醬時(shí)制曲的經(jīng)驗(yàn)所采用的一種保藏方法，適用于谷物微生物區(qū)系中的種類。

L－干燥法

又稱液體干燥法或真空干燥法。用含3%谷氨酸鈉的0.1M磷酸緩沖溶液（pH7.0）做分散媒，將待保藏的微生物制成高濃度的細(xì)胞懸液，滴入無菌安瓿瓶中，每管0.05毫升；將安瓿瓶固定在多歧管上，并以水浴保持安瓿瓶內(nèi)樣品溫度為10℃，在13.3～1.3帕的真空度下干燥，火焰封管保存。此法不經(jīng)凍結(jié)，用真實(shí)泵迅速抽干，可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應(yīng)用于病毒、噬菌體、細(xì)菌、酵母菌、藍(lán)藻、原生動(dòng)物等。

梭氏法

將容有1滴細(xì)胞懸液的小管，置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中，用真空泵抽至1.3帕?xí)r，將大試管密封保存。這是為減少細(xì)胞死亡率而采取的一種不經(jīng)凍結(jié)、緩慢脫水的干燥保藏法，適用于多種細(xì)菌、真菌。

冷凍真空干燥法

將細(xì)胞懸液每0.1～0.2毫升注入一無菌安瓿瓶，于－40℃預(yù)凍1小時(shí)，再于－20～30℃、真空度為13.3帕的條件下脫水。在脫水過程后期，安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水后的樣品含水量應(yīng)在3%以下。最后，將安瓿瓶保持真空度1.3帕，用火焰溶封，置10℃保存。為防止細(xì)胞在凍結(jié)和脫水過程中損傷或死亡，要用保護(hù)劑制備細(xì)胞懸液。保護(hù)劑有脫脂牛奶、血清、10%蔗糖或葡萄糖溶液等，其作用是通過氧和離子鍵對(duì)水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒、衣原體、枝原體、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等的長期保存，是當(dāng)前保藏菌種的一個(gè)重要方法。但是，鹽桿菌、發(fā)光桿菌、粘桿菌、阿舒囊霉、多囊霉、擔(dān)子菌中的大多數(shù)屬種不適用于此法保存。

液態(tài)氮超低溫凍結(jié)法

用甘油或二甲亞砜（DMSO）作保護(hù)劑制備細(xì)胞懸液，分裝入無菌安瓿瓶，每管0.2毫升，在控制溫度下降速率為1℃／分鐘的條件下預(yù)凍至－40℃，然后立即放入液氮生物貯存罐中氣相（－150℃）保存?；謴?fù)培養(yǎng)時(shí)，先直接侵入38℃水浴中解凍5～10分鐘，再種植于適宜培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)。這是根據(jù)在低于－130℃時(shí)一切生化反應(yīng)處于停止?fàn)顟B(tài)、微生物也不能進(jìn)行代謝活動(dòng)而設(shè)計(jì)的凍結(jié)法。為避免凍死、凍傷和細(xì)胞內(nèi)形成大量冰晶，用保護(hù)劑制備懸液并控制預(yù)凍時(shí)的冷卻速率和解凍時(shí)融化速率。微生物的大多數(shù)屬種適于慢速凍結(jié)和快速解凍。此法適用于病毒、枝原體、各種細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、藍(lán)藻等。

分工和機(jī)構(gòu)

菌種保藏可按微生物各分支學(xué)科的專業(yè)性質(zhì)分為普通、工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)、抗生素等保藏管理中心。此外，也可按微生物類群進(jìn)行分工，如沙門氏菌、弧菌、根瘤菌、乳酸桿菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌、藻類等保藏中心。

目前，世界上約有550個(gè)菌種保藏機(jī)構(gòu)。其中著名的有：

1.美國菌種保藏中心（簡稱ATCC，馬里蘭）：1925年建立，是世界上最大的、保存微生物種類和數(shù)量最多的機(jī)構(gòu)，保存病毒、衣原體、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、真菌、藻類、原生動(dòng)物等約29000株，都是典型株。

2.荷蘭真菌菌種保藏中心（簡稱CBS，得福特）：1904年建立，保存酵母菌、絲狀真菌約8400種、18000株，大多是模式株。

3.英國全國菌種保藏中心（簡稱NCTC，倫敦）：保存醫(yī)用和獸醫(yī)用病原微生物約2740株。

4.英聯(lián)邦真菌研究所（簡稱CMI，薩里郡）：保存真菌模式株、生理生化和有機(jī)合成等菌種2763種，8000株。

5.日本大阪發(fā)酵研究所（簡稱IFO，大阪）：保存普通和工業(yè)微生物菌種約9000株。

6.美國農(nóng)業(yè)部北方利用研究開發(fā)部（北方地區(qū)研究室，簡稱NRRL，伊利諾伊州皮契里亞）：收藏農(nóng)業(yè)、工業(yè)、微生物分類學(xué)所涉及的菌種，包括細(xì)菌5000株，絲狀真菌1700株、酵母菌6000株。

1970年8月在墨西哥城舉行的第10屆國際微生物學(xué)代表大會(huì)上成立了世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)（簡稱WFCC），同時(shí)確定澳大利亞昆士蘭大學(xué)微生物系為世界資料中心。這個(gè)中心用電子計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存全世界各菌種保藏機(jī)構(gòu)的有關(guān)情報(bào)和資料，1972年出版《世界菌種保藏名錄》。

中國于1979年成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)。