動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)_動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

任務(wù)5　動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)

近數(shù)十年來(lái)，由于人類對(duì)生長(zhǎng)激素、干擾素、單克隆抗體、疫苗及白細(xì)胞介素等生物制品的需求猛增，以傳統(tǒng)的生物化學(xué)技術(shù)從動(dòng)物組織獲取生物制品，因產(chǎn)量少、質(zhì)量不均且不易控制穩(wěn)定，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足這一需求。

隨著細(xì)胞培養(yǎng)的原理與方法日臻完善，能進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)用的生物反應(yīng)器種類越來(lái)越多，規(guī)模也越來(lái)越大。人工條件下（pH值、溫度、溶解氧等），在細(xì)胞生物反應(yīng)器中高密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用于生產(chǎn)生物制品的技術(shù)稱為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。

一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)應(yīng)用簡(jiǎn)介

動(dòng)物細(xì)胞是一種無(wú)細(xì)胞壁的真核細(xì)胞，生長(zhǎng)緩慢，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境十分敏感。采用傳統(tǒng)的生物化工技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大量培養(yǎng)，除了要滿足培養(yǎng)過程必需的營(yíng)養(yǎng)要求外，有必要建立合理的控制模型，進(jìn)行pH值和溶解氧（DO）的最佳控制。

細(xì)胞生物反應(yīng)器就是可以大規(guī)模體外培養(yǎng)哺乳類動(dòng)物細(xì)胞的裝置。通過微機(jī)有序地定量地控制加入動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐內(nèi)的空氣、氧氣、氮?dú)夂投趸妓姆N氣體的流量，使其保持最佳的比例來(lái)控制細(xì)胞培養(yǎng)液中的pH值和溶解氧水平，使系統(tǒng)始終處于最佳狀態(tài)，以滿足動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)pH值和溶解氧的需要。如主要采用改變通入培養(yǎng)罐內(nèi)氣體中氧氣和氮?dú)獾谋壤齺?lái)實(shí)現(xiàn)控制DO值的目的，提高或達(dá)到一定的溶解氧水平，采用二氧化碳-碳酸氫鈉（CO₂-NaHCO₃）緩沖液來(lái)控制培養(yǎng)液的pH值。

20世紀(jì)60—70年代，可用于大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)和中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)誕生了。幾十年來(lái)，大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)有了很大發(fā)展，從使用轉(zhuǎn)瓶、貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，發(fā)展為利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，徹底解決了第一代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的核心問題——難以產(chǎn)業(yè)化（規(guī)模化）生產(chǎn)，不但工藝上能滿足大規(guī)模制備產(chǎn)品的要求，還能保證產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，質(zhì)量控制簡(jiǎn)便易行。

由于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全、有效的，因此人們對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)發(fā)生了改變。許多人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物和疫苗，尤其是對(duì)那些相對(duì)較大、較復(fù)雜或糖基化的蛋白質(zhì)來(lái)說，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。20世紀(jì)60年代初，英國(guó)AVRI研究所在貼壁細(xì)胞系BHK21中將口蹄疫病毒培養(yǎng)成功后，從最初的200mL和800mL玻璃容器開始，很快就放大到30L和100L不銹鋼罐的培養(yǎng)規(guī)模。1967年以后，英國(guó)Wellcome集團(tuán)分布于歐洲、非洲和南美洲8個(gè)國(guó)家的生產(chǎn)廠，應(yīng)用此項(xiàng)技術(shù)工業(yè)化生產(chǎn)口蹄疫疫苗和獸用狂犬病疫苗，Wellcome公司目前不僅掌握了5000L罐的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，還采用8000L Namalwa細(xì)胞生產(chǎn)了α干擾素。此外，英國(guó)Celltech公司可以用氣升式生物反應(yīng)器生產(chǎn)α干擾素、β干擾素和γ干擾素，用無(wú)血清培養(yǎng)液在10000L氣升式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。美國(guó)Endotronic公司用中空纖維生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，生產(chǎn)出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長(zhǎng)激素等。

目前大規(guī)模體外培養(yǎng)技術(shù)已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的產(chǎn)品有口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、皰疹病毒疫苗、巨細(xì)胞病毒疫苗、α干擾素、β干擾素、γ干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細(xì)胞素、松弛素、生長(zhǎng)激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。

二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)常用方法

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器要求控制條件精確、方便可行，因此了解在生物反應(yīng)器中動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性、不同細(xì)胞類型所需的生存條件與工藝控制參量等，對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng)操作非常重要，下面先介紹動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的基礎(chǔ)知識(shí)。

（一）動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí)

1.生長(zhǎng)特性

在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中，絕大多數(shù)細(xì)胞所具有的生長(zhǎng)特性如下：

（1）細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，易污染，培養(yǎng)需用抗生素；

（2）細(xì)胞大，無(wú)細(xì)胞壁，機(jī)械強(qiáng)度低，環(huán)境適應(yīng)性差；

（3）需氧少，不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌；

（4）群體生長(zhǎng)效應(yīng)，貼壁生長(zhǎng)；

（5）培養(yǎng)產(chǎn)品分布于細(xì)胞內(nèi)外，分離純化成本高；

（6）原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡。

2.細(xì)胞培養(yǎng)類型

依據(jù)在體外培養(yǎng)時(shí)對(duì)生長(zhǎng)基質(zhì)依賴性的差異，動(dòng)物細(xì)胞可分為以下兩類。

（1）貼壁依賴性細(xì)胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類。

（2）非貼壁依賴性細(xì)胞：無(wú)須附著于固相表面即可生長(zhǎng)的細(xì)胞。包括血液、淋巴組織細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

3.培養(yǎng)需要的溫度

培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度相當(dāng)于各種細(xì)胞或組織取材時(shí)機(jī)體的正常溫度。人和哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度為35～37℃。偏離這一溫度，細(xì)胞正常的代謝和生長(zhǎng)將會(huì)受到影響，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。總的來(lái)說，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力比對(duì)高溫的高。溫度不超過39℃時(shí)，細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比；細(xì)胞培養(yǎng)若置于39～40℃環(huán)境中1h，即受到一定損傷，但仍能恢復(fù)，當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時(shí)，細(xì)胞原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平；當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時(shí)，許多細(xì)胞將死亡。

（二）大規(guī)模培養(yǎng)方法

根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的類型和需要的條件，可采用貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。

1.貼壁培養(yǎng)

貼壁培養(yǎng)為細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。

（1）生長(zhǎng)特性。

貼壁依賴性細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)要貼附于培養(yǎng)器皿（瓶）壁上，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。

（2）貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)。

①容易更換培養(yǎng)液。細(xì)胞緊密黏附于固相表面，可直接傾去舊培養(yǎng)液，清洗后直接加入新培養(yǎng)液。

②容易采用灌注培養(yǎng)，從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的。因細(xì)胞固定于表面，不需過濾系統(tǒng)。

③當(dāng)細(xì)胞貼附于生長(zhǎng)基質(zhì)時(shí)，很多細(xì)胞將更有效地表達(dá)一種產(chǎn)品。

④同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液與細(xì)胞比。

⑤適用于所有類型的細(xì)胞。

（3）貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)。

與懸浮培養(yǎng)相比，貼壁培養(yǎng)也具有一些缺點(diǎn)：

①擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大；

②占地面積大；

③不能有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)。

（4）細(xì)胞貼壁表面。

要求細(xì)胞貼壁表面具有凈陽(yáng)電荷和高度表面活性，對(duì)微載體而言還要求具有一定電荷密度；若為有機(jī)物表面，必須具有親水性，并帶陽(yáng)電荷。

（5）貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)。

貼壁培養(yǎng)系統(tǒng)主要有轉(zhuǎn)瓶、中空纖維、玻璃珠、微載體系統(tǒng)等。

①轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于少量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段，或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器——轉(zhuǎn)瓶中，培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣，從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，技術(shù)成熟，重復(fù)性好，放大只需簡(jiǎn)單地增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點(diǎn)。但轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)也有其缺點(diǎn)：勞動(dòng)強(qiáng)度大，占地面積大，單位體積提供細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積小，細(xì)胞生長(zhǎng)密度低，培養(yǎng)時(shí)不便于監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境條件等?，F(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括CO₂培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩類。

②貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器：細(xì)胞貼附于固定的表面生長(zhǎng)，不因?yàn)閿嚢瓒S培養(yǎng)液一起流動(dòng)，因此比較容易更換培養(yǎng)液，不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備，可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度，能有效地獲得一種產(chǎn)品，但擴(kuò)大規(guī)模較難，不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，故多用于制備用量較小、價(jià)值高的生物藥品。

CelliGen、CelliGen Plus^TM和Bioflo3000反應(yīng)器是常用的貼壁培養(yǎng)式生物反應(yīng)器，用于細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時(shí)可用籃式攪拌系統(tǒng)和圓盤狀載體。圓盤狀載體是直徑為6mm的無(wú)紡聚酯纖維圓片，具有很高的表面積與體積比，有利于獲得高細(xì)胞密度?；@式攪拌系統(tǒng)和載體培養(yǎng)是目前貼壁細(xì)胞培養(yǎng)使用最多的方式，可用于雜交瘤細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、293細(xì)胞、CHO細(xì)胞及其他細(xì)胞的培養(yǎng)。用此種方式培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞接種后貼壁快。

2.懸浮培養(yǎng)

懸浮培養(yǎng)為細(xì)胞在反應(yīng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)，主要用于非貼壁依賴性細(xì)胞（如雜交瘤細(xì)胞等）的培養(yǎng)，它是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的。

無(wú)血清懸浮培養(yǎng)是用已知人源或動(dòng)物來(lái)源的蛋白質(zhì)或激素代替動(dòng)物血清的一種細(xì)胞培養(yǎng)方式，它能減少后期純化工作，提高產(chǎn)品質(zhì)量，正逐漸成為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的新方向。

3.固定化培養(yǎng)

固定化培養(yǎng)是將動(dòng)物細(xì)胞與水不溶性載體結(jié)合起來(lái)，再進(jìn)行培養(yǎng)。它對(duì)于上述兩大類細(xì)胞都適用，具有細(xì)胞生長(zhǎng)密度高、抗剪切力和抗污染能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞易于與產(chǎn)物分開，有利于產(chǎn)物分離純化。制備方法很多，包括吸附法、共價(jià)貼附法、離子／共價(jià)交聯(lián)法、包埋法、微囊法等。

（1）吸附法。

吸附法是用固體吸附劑將細(xì)胞吸附在其表面而使細(xì)胞固定化的方法。此法操作簡(jiǎn)便、條件溫和，是動(dòng)物細(xì)胞固定化中最早研究使用的方法。其缺點(diǎn)是載體的負(fù)荷能力低，細(xì)胞易脫落。微載體培養(yǎng)和中空纖維培養(yǎng)是該方法的代表。

（2）共價(jià)貼附法。

共價(jià)貼附法是利用共價(jià)鍵將動(dòng)物細(xì)胞與固相載體結(jié)合的固定化方法。此法可減少細(xì)胞的泄漏，但須引入化學(xué)試劑，對(duì)細(xì)胞活性有影響，且貼附導(dǎo)致擴(kuò)散限制小，細(xì)胞得不到保護(hù)。

（3）離子／共價(jià)交聯(lián)法。

用雙功能試劑處理細(xì)胞懸浮液，會(huì)在細(xì)胞間形成橋而產(chǎn)生交聯(lián)作用，此固定化細(xì)胞的方法稱為離子／共價(jià)交聯(lián)法。交聯(lián)試劑會(huì)使一些細(xì)胞死亡，也會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)散限制。

（4）包埋法。

包埋法是將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部制成固定化細(xì)胞的方法。其優(yōu)點(diǎn)是步驟簡(jiǎn)單、條件溫和、負(fù)荷量大、細(xì)胞泄漏少、抗機(jī)械剪切。其缺點(diǎn)是產(chǎn)生擴(kuò)散限制，并非所有細(xì)胞都處于最佳基質(zhì)濃度，且大分子基質(zhì)不能滲透到高聚物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部。一般適用于非貼壁依賴性細(xì)胞的固定化，常用載體為多孔凝膠，如瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白。

（5）微囊法。

微囊法是用一層親水的半透膜將細(xì)胞包圍在珠狀的微囊里，使細(xì)胞不能逸出，但小分子物質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可自由出入半透膜的方法。囊內(nèi)是一種微小的培養(yǎng)環(huán)境，與液體培養(yǎng)相似，能保護(hù)細(xì)胞少受損傷，故細(xì)胞生長(zhǎng)好、密度高。微囊直徑以200～400μm為宜。制備微囊時(shí)注意以下幾個(gè)方面：

①應(yīng)溫和、快速、不損傷細(xì)胞，盡量在液體和生理?xiàng)l件下操作；

②所用試劑和膜材料對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害；

③膜的孔徑可控制，必須讓營(yíng)養(yǎng)物和代謝物自由通過；

④膜應(yīng)有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以抵抗培養(yǎng)中的攪拌作用。

（三）抗凋亡策略在細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中的應(yīng)用

在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)過程中，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞死亡中占主要部分。最近研究顯示，在大規(guī)模培養(yǎng)生物反應(yīng)器中，細(xì)胞的死亡中80%是由凋亡所導(dǎo)致的，而不是以前所認(rèn)為的壞死。在動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中，細(xì)胞死亡是維持細(xì)胞高活性和高密度的最大障礙，因此從理論上講減少凋亡，防止死亡或延長(zhǎng)細(xì)胞壽命，可以極大提高生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組蛋白的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。

細(xì)胞凋亡由一系列基因精確地調(diào)控，是多細(xì)胞生物發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必需的生理活動(dòng)。已知凋亡的最終執(zhí)行者是Caspase家族，它們均為半胱氨酸蛋白酶，各識(shí)別一個(gè)4氨基酸序列，并在識(shí)別序列C端天冬氨酸殘基處將底物切斷。Caspase含有可被自身識(shí)別的序列，可以切割活化自身而導(dǎo)致信號(hào)放大，并作用于下游Caspase成員，從而形成Caspase家族的級(jí)聯(lián)放大，最終作用于效應(yīng)蛋白，引起細(xì)胞凋亡。所以在大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)干擾細(xì)胞在培養(yǎng)中的凋亡，提高細(xì)胞特異性抵抗壓力的能力，有利于提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度、延長(zhǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)周期，從而可使目標(biāo)產(chǎn)品的產(chǎn)量提高2～3倍。

（1）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)抗凋亡。

在常規(guī)生物反應(yīng)器中，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭或缺乏培養(yǎng)基中特殊的生長(zhǎng)因子可引起凋亡，例如血清、糖或特殊氨基酸耗竭。在培養(yǎng)基中添加氨基酸或其他關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可抑制凋亡，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間從而提高產(chǎn)品的產(chǎn)量。大規(guī)模培養(yǎng)中細(xì)胞凋亡主要由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的耗竭或代謝產(chǎn)物的堆積，如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)。另外，動(dòng)物細(xì)胞在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。

（2）基因抗凋亡。

可對(duì)與凋亡相關(guān)的一系列基因產(chǎn)物進(jìn)行正、負(fù)向的調(diào)控，因此可通過導(dǎo)入相應(yīng)基因來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗凋亡活性。

（3）化學(xué)方法抗凋亡。

凋亡發(fā)生時(shí)細(xì)胞許多部位發(fā)生生化物質(zhì)的改變，有些變化（如改變細(xì)胞氧化還原條件產(chǎn)生活性氧）發(fā)生在凋亡信號(hào)階段，其他的（如破壞線粒體膜電位、激活Caspase）則發(fā)生在凋亡效應(yīng)階段，這在絕大多數(shù)細(xì)胞死亡中是相同的。因此，阻止這些生化物質(zhì)的改變可能阻止、至少延遲細(xì)胞凋亡的發(fā)生，運(yùn)用化學(xué)物質(zhì)抑制信號(hào)、效應(yīng)階段的發(fā)生，被認(rèn)為是抗調(diào)亡策略之一。

三、細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式

細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的操作方式可分為分批式培養(yǎng)、流加式培養(yǎng)、半連續(xù)式培養(yǎng)、連續(xù)式培養(yǎng)、灌注式培養(yǎng)和細(xì)胞工廠培養(yǎng)六種。

（一）分批式培養(yǎng)

1.分批式培養(yǎng)的概念

分批式培養(yǎng)是細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)展進(jìn)程中較早采用的方式，也是其他操作方式的基礎(chǔ)。該方式是采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，將細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后，一次性轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中其體積不變，不添加其他成分，待細(xì)胞增長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和積累到適當(dāng)?shù)臅r(shí)期，一次性收獲細(xì)胞、產(chǎn)物、培養(yǎng)基的操作方式。在分批培養(yǎng)過程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)分為五個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、平臺(tái)期和衰退期。培養(yǎng)周期多為3～5d，細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)為細(xì)胞先經(jīng)歷對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（48～72h），細(xì)胞密度達(dá)到最高值后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗竭或代謝毒副產(chǎn)物的積累，細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入衰退期進(jìn)而死亡，表現(xiàn)出典型的周期性。收獲產(chǎn)物通常是在細(xì)胞快要死亡時(shí)或已經(jīng)死亡后進(jìn)行。

2.分批式培養(yǎng)的特點(diǎn)

分批式培養(yǎng)具有以下特點(diǎn)。

（1）操作簡(jiǎn)單。培養(yǎng)周期短，染菌和細(xì)胞突變的風(fēng)險(xiǎn)小。反應(yīng)器系統(tǒng)屬于封閉式，培養(yǎng)過程中與外部環(huán)境沒有物料交換，除了控制溫度、pH值和通氣外，不進(jìn)行其他任何控制，因此操作簡(jiǎn)單，容易掌握。

（2）可直觀地反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程。因培養(yǎng)期間細(xì)胞生長(zhǎng)代謝是在一個(gè)相對(duì)固定的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境內(nèi)，不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分，因此可直觀地反映細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的過程，是確定工藝基礎(chǔ)條件或“小試”研究常用的手段。

（3）可直接放大。由于培養(yǎng)過程工藝簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備和控制的要求較低，設(shè)備的通用性強(qiáng)，反應(yīng)器參數(shù)的放大原理和過程控制較其他培養(yǎng)系統(tǒng)的較易理解和掌握。在工業(yè)化生產(chǎn)中，分批式培養(yǎng)操作是傳統(tǒng)的、常用的方法，Genetech公司采用的此類工業(yè)反應(yīng)器規(guī)?？蛇_(dá)12000L。

（二）流加式培養(yǎng)

1.流加式培養(yǎng)的概念

流加式培養(yǎng)是在分批式培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞或以懸浮微載體培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。細(xì)胞初始接種的培養(yǎng)基體積一般為終體積的1／3～1／2，在培養(yǎng)過程中根據(jù)細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗和需求，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)物或培養(yǎng)基，從而使細(xì)胞持續(xù)生長(zhǎng)至較高的密度，目標(biāo)產(chǎn)品濃度達(dá)到較高的水平，整個(gè)培養(yǎng)過程沒有流出或回收，通常在細(xì)胞進(jìn)入衰退期或衰退期后終止、回收整個(gè)反應(yīng)體系，分離細(xì)胞和細(xì)胞碎片，濃縮、純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。

2.流加式培養(yǎng)的特點(diǎn)

流加式培養(yǎng)具有以下特點(diǎn)。

（1）流加式培養(yǎng)需根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速率、營(yíng)養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。流加的速率與消耗的速率應(yīng)相等，按底物濃度控制相應(yīng)的流加過程，保證合理的培養(yǎng)環(huán)境與較低的代謝產(chǎn)物抑制水平。

（2）培養(yǎng)過程以低稀釋率流加，細(xì)胞在培養(yǎng)系統(tǒng)中停留時(shí)間較長(zhǎng)，總細(xì)胞密度較高，產(chǎn)物濃度較高。

（3）研究流加式培養(yǎng)過程須掌握細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、能量代謝動(dòng)力學(xué)，研究細(xì)胞環(huán)境變化時(shí)的瞬間行為。流加式培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和培養(yǎng)條件與環(huán)境的優(yōu)化，是整個(gè)培養(yǎng)工藝中的主要內(nèi)容。

（4）在工業(yè)化生產(chǎn)中，懸浮式流加培養(yǎng)工藝參數(shù)的放大原理和過程控制，比其他培養(yǎng)系統(tǒng)的較易理解和掌握，可采用工藝參數(shù)直接放大。

流加式培養(yǎng)是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中主要的培養(yǎng)工藝，也是近年來(lái)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。流加式培養(yǎng)中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)基和流加濃縮的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。通常進(jìn)行流加的時(shí)間多在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，在細(xì)胞進(jìn)入衰退期之前，添加高濃度的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)?？梢蕴砑右淮?，也可添加多次，為了追求更高的細(xì)胞密度往往需要添加一次以上，直至細(xì)胞密度不再提高；可進(jìn)行脈沖式添加，也可以較低的速率緩慢添加，但為了盡可能地維持相對(duì)穩(wěn)定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境，后者采用得較多；添加的成分比較多，凡是促細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)均可以進(jìn)行添加。流加的總體原則是維持細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，營(yíng)養(yǎng)成分既不會(huì)過剩而產(chǎn)生大量的代謝副產(chǎn)物，造成營(yíng)養(yǎng)利用效率下降，也不會(huì)缺乏而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制或死亡。

3.流加工藝中的營(yíng)養(yǎng)成分

（1）葡萄糖。

葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的碳源物質(zhì)，但當(dāng)其濃度較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要對(duì)其濃度進(jìn)行控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。

（2）谷氨酰胺。

谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的氮源物質(zhì)，但當(dāng)其濃度較高時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要對(duì)其濃度進(jìn)行控制，以足夠維持細(xì)胞生長(zhǎng)而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。如果谷氨酰胺耗竭，也會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞凋亡，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)。

（3）氨基酸、維生素及其他營(yíng)養(yǎng)成分。

主要包括營(yíng)養(yǎng)必需氨基酸、營(yíng)養(yǎng)非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸（如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸），此外還包括其他營(yíng)養(yǎng)成分如膽堿、生長(zhǎng)因子。添加的氨基酸多為左旋氨基酸，因而多以鹽或前體的形式代替單分子氨基酸，或者以四肽或短肽的形式添加。在進(jìn)行添加時(shí)，不溶性氨基酸（如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸）只在中性時(shí)部分溶解，可采用漿液的形式進(jìn)行脈沖式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕動(dòng)泵緩慢流加。

4.流加式培養(yǎng)的類型

流加式培養(yǎng)分為以下兩種類型。

（1）單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)。

單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在培養(yǎng)開始時(shí)投入一定量的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，培養(yǎng)到一定時(shí)期，開始連續(xù)補(bǔ)加濃縮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直到培養(yǎng)液體積達(dá)到生物反應(yīng)器的最大操作容積，停止補(bǔ)加，最后將細(xì)胞培養(yǎng)液一次性全部放出。該操作方式受到生物反應(yīng)器操作容積的限制，培養(yǎng)周期只能控制在較短的時(shí)間內(nèi)。

（2）反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)。

反復(fù)補(bǔ)料分批式培養(yǎng)是在單一補(bǔ)料分批式培養(yǎng)操作的基礎(chǔ)上，每隔一定時(shí)間按一定比例放出一部分培養(yǎng)液，使培養(yǎng)液體積始終不超過生物反應(yīng)器的最大操作容積，從而在理論上可以延長(zhǎng)培養(yǎng)周期，直至培養(yǎng)效率下降，才將培養(yǎng)液全部放出。

（三）半連續(xù)式培養(yǎng)

1.半連續(xù)式培養(yǎng)的概念

半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。它采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器的懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，每隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使生物反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。

這種類型的操作是將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長(zhǎng)至一定的密度，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋至生物反應(yīng)器培養(yǎng)體積的1／2～3／4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加?；蛘咴诩?xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物或條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，并補(bǔ)加細(xì)胞、載體或新鮮的培養(yǎng)基，然后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而不需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式培養(yǎng)操作中，由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。

2.半連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)

半連續(xù)式培養(yǎng)具有以下特點(diǎn)：

（1）培養(yǎng)物的體積逐步增加；

（2）可進(jìn)行多次收獲；

（3）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞濃度在一較高的水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。

該操作方式操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平，因而在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。

（四）連續(xù)式培養(yǎng)

1.連續(xù)式培養(yǎng)的概念

連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，所使用的生物反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式生物反應(yīng)器。連續(xù)式培養(yǎng)是將細(xì)胞接種于一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)到最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器中連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物同時(shí)以相同的速度連續(xù)從生物反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。從理論上講，該過程可無(wú)限延續(xù)下去。

2.連續(xù)式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

連續(xù)式培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）細(xì)胞維持指數(shù)增長(zhǎng)；

（2）產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng)；

（3）可控制衰退期與下降期。

連續(xù)式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是生物反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)，可有效地延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在穩(wěn)定狀態(tài)下，細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率可保持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來(lái)的生理影響，特別是生物反應(yīng)器內(nèi)主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺維持在一個(gè)較低的水平，從而使它們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片被及時(shí)清除，可是細(xì)胞和產(chǎn)物被不斷地稀釋，造成營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生成速率低下。

3.連續(xù)式培養(yǎng)的缺點(diǎn)

連續(xù)式培養(yǎng)的缺點(diǎn)如下：

（1）由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染；

（2）在長(zhǎng)周期的連續(xù)式培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異；

（3）對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。

（五）灌流式培養(yǎng)

1.灌流式培養(yǎng)的概念

灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入生物反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式培養(yǎng)操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在生物反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)式培養(yǎng)在取出培養(yǎng)物的同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。

灌流式培養(yǎng)使用的生物反應(yīng)器主要有兩種。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種生物反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截留裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜可透過相對(duì)分子質(zhì)量較小的產(chǎn)物和底物，截留細(xì)胞和相對(duì)分子質(zhì)量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過程中將絕大部分細(xì)胞截留在生物反應(yīng)器內(nèi)。近年來(lái)中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。

另一種是固定床或流化床生物反應(yīng)器。固定床生物反應(yīng)器是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚酯纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長(zhǎng)，也可固定在載體纖維之間，靠攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中可高密度生長(zhǎng)。流化床生物反應(yīng)器是通過流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。

2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

灌流式培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）細(xì)胞截留系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在生物反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)每毫升10⁷～10⁹個(gè)，從而較大地提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量；

（2）連續(xù)灌流系統(tǒng)使細(xì)胞穩(wěn)定地處在較好的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝產(chǎn)物濃度較低；

（3）反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高；

（4）產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。

灌流式培養(yǎng)是近年用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應(yīng)用灌流工藝的公司有Genzyme、Genetic Institute、Bayer公司等。這種方法最大的困難是污染概率較大，還存在長(zhǎng)期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性問題、規(guī)模放大過程中的工程問題。

（六）細(xì)胞工廠培養(yǎng)

細(xì)胞工廠（cell factory）是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)最大限度地利用了培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的生產(chǎn)空間，并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無(wú)菌性，從而避免因污染而帶來(lái)的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。

丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細(xì)胞工廠是目前應(yīng)用較多的細(xì)胞工廠系統(tǒng)，可用于疫苗、單克隆抗體等的工業(yè)化生產(chǎn)，特別適合于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行放大時(shí)不會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)條件，可提供1盤、2盤、10盤和40盤的規(guī)格，使放大變得簡(jiǎn)單易行，污染風(fēng)險(xiǎn)低，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測(cè)試保證最有利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)。同時(shí)，與NUNC細(xì)胞工廠操作儀結(jié)合使用，可全面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化，從而大大地降低勞動(dòng)強(qiáng)度。這套系統(tǒng)使用很方便；由組織培養(yǎng)級(jí)聚苯乙烯制成，使用后處理也很方便。

細(xì)胞工廠最大的缺點(diǎn)是經(jīng)胰蛋白酶消化后，很難將細(xì)胞完全洗出。

四、微載體培養(yǎng)技術(shù)

（一）微載體培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用簡(jiǎn)介

微載體培養(yǎng)技術(shù)于1967年被用于動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)。經(jīng)過三十余年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)成熟，并廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。微載體培養(yǎng)是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)，兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，容易放大。目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型的細(xì)胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質(zhì)產(chǎn)品，如293細(xì)胞、成肌細(xì)胞、Vero細(xì)胞、CHO細(xì)胞等。

使用較多的反應(yīng)器有兩種：貝朗公司的BIOSTAT Cplus反應(yīng)器，使用雙槳葉無(wú)氣泡通氣攪拌系統(tǒng)；NBS公司的CelliGen、CelliGen Plus^TM和Bioflo3000反應(yīng)器，使用Cell-lift雙篩網(wǎng)攪拌系統(tǒng)。兩種系統(tǒng)都能實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物的有效分離。微載體培養(yǎng)設(shè)備如圖1-54所示。

圖1-54　微載體培養(yǎng)設(shè)備

（二）微載體理論

微載體是指直徑在60～250μm，能適用于貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)的微珠，一般由天然葡聚糖或者各種人工聚合物組成。自van Wezel用DEAE-Sephadex A50研制的第一種微載體問世以來(lái)，國(guó)際市場(chǎng)上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達(dá)十幾種，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質(zhì)微載體、聚氨酯泡沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有以下幾種：Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3，Cytopore和Cytoline。

（1）微載體的大?。涸龃髥挝惑w積內(nèi)的表面積對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)非常有利。應(yīng)使微載體直徑盡可能小，最好控制在200μm以下。

（2）微載體的密度：一般為1.03～1.05g／cm³，隨著細(xì)胞的貼附及生長(zhǎng)，密度可逐漸增大。

（3）微載體的表面電荷：據(jù)研究，控制細(xì)胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質(zhì)。若電荷密度太低，細(xì)胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會(huì)產(chǎn)生“毒性”效應(yīng)。

（三）微載體培養(yǎng)的原理與操作

1.原理

微載體培養(yǎng)的原理是將對(duì)細(xì)胞無(wú)害的顆?！⑤d體（圖1-55）加入培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，作為載體，使細(xì)胞在微載體表面附著生長(zhǎng)，同時(shí)通過持續(xù)攪動(dòng)使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。

貼壁依賴性細(xì)胞在微載體表面上的增殖要經(jīng)歷黏附貼壁、生長(zhǎng)和擴(kuò)展成單層三個(gè)階段。細(xì)胞只有貼附在固體基質(zhì)表面才能增殖，故細(xì)胞在微載體表面的貼附是進(jìn)一步鋪展和生長(zhǎng)的關(guān)鍵。貼附主要是靠靜電引力和范德華力。細(xì)胞在微載體表面貼附主要取決于細(xì)胞與微載體的接觸概率和相融性。

圖1-55　微載體

2.攪拌轉(zhuǎn)速

由于動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁，對(duì)剪切力敏感，因而無(wú)法靠提高攪拌轉(zhuǎn)速來(lái)增加接觸概率。通常的操作方式是在貼壁期采用低攪拌轉(zhuǎn)速，時(shí)攪時(shí)停；數(shù)小時(shí)后，待細(xì)胞附著于微載體表面時(shí)，維持設(shè)定的低轉(zhuǎn)速，進(jìn)入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，最大轉(zhuǎn)速為75r／min。

3.細(xì)胞與微載體的相融性

細(xì)胞與微載體的相融性與微載體表面理化性質(zhì)有關(guān)。一般細(xì)胞在進(jìn)入生理pH值環(huán)境時(shí)，表面帶負(fù)電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細(xì)胞貼壁速度。若微載體帶負(fù)電荷，靜電斥力使細(xì)胞難于黏附貼壁，但當(dāng)培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價(jià)陽(yáng)離子作為媒介時(shí)，則帶負(fù)電荷的細(xì)胞也能貼附。

4.細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng)

影響細(xì)胞在微載體表面生長(zhǎng)的因素很多，主要有以下三個(gè)方面。

（1）細(xì)胞方面，如細(xì)胞群體、狀態(tài)和類型。

（2）微載體方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子。微載體表面光滑時(shí)細(xì)胞擴(kuò)展快，表面多孔則擴(kuò)展慢。

（3）培養(yǎng)環(huán)境方面，如培養(yǎng)基組成、溫度、pH值以及代謝廢物等均明顯影響細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)。如果所處條件最優(yōu)，則細(xì)胞生長(zhǎng)快；反之，則細(xì)胞生長(zhǎng)慢。

5.微載體培養(yǎng)操作的要點(diǎn)

（1）培養(yǎng)初期：保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的pH值與溫度水平，接種細(xì)胞（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而非穩(wěn)定期）至終體積1／3的培養(yǎng)液中，以增加細(xì)胞與微載體接觸的機(jī)會(huì)。不同的微載體所用濃度及接種細(xì)胞密度是不同的，常采用2～3g／L的微載體含量，微載體濃度更高時(shí)需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。

（2）貼壁階段（3～8d）后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增大攪拌速度保證完全均質(zhì)混合。

（3）培養(yǎng)維持期：進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)（胞核計(jì)數(shù)）、葡萄糖測(cè)定及細(xì)胞形態(tài)鏡檢。隨著細(xì)胞增殖，微珠會(huì)變得越來(lái)越重，需增大攪拌速度。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液。停止攪拌，讓微載體沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入新鮮培養(yǎng)液（37℃），重新開始攪拌。

（4）收獲細(xì)胞：首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗一遍，然后加入相應(yīng)的酶，攪拌（75～125r／min）20～30min，然后收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。

（5）微載體培養(yǎng)的放大：可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進(jìn)行放大。使用異倍體或原代細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。

（四）微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)

微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中細(xì)胞擴(kuò)增的效率受到諸多因素的影響和限制，其中主要的限制性因素包括細(xì)胞對(duì)剪切力的敏感性、氧的傳遞以及傳代和擴(kuò)大培養(yǎng)等。而研制的各種類型生物反應(yīng)器系統(tǒng)則可針對(duì)上述限制性因素，為微載體細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增提供低剪切力、高氧傳遞效率、易于細(xì)胞傳代等適宜的外部環(huán)境。已較多使用的微載體培養(yǎng)系統(tǒng)生物反應(yīng)器，其操作可以實(shí)行計(jì)算機(jī)控制，攪拌速度及懸浮均勻程度、溫度、pH值、溶解氧供應(yīng)（O₂、N₂、CO₂、空氣四種純化氣體按比例調(diào)節(jié)）、罐壓、培養(yǎng)體積和通氣量等參數(shù)全部由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制。因此，應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行微載體細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增具有明顯優(yōu)勢(shì)，目前國(guó)外相繼研制了數(shù)種適合進(jìn)行微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器系統(tǒng)，如攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)、灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)以及旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)等。

1.攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)

攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)在微載體細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增研究領(lǐng)域已有較長(zhǎng)的研究歷史，但因該細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)容易產(chǎn)生過大的剪切力，從而限制了其應(yīng)用范圍。盡管如此，由于該系統(tǒng)具有簡(jiǎn)單、實(shí)用及價(jià)格低廉等特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外仍有不少應(yīng)用該系統(tǒng)成功進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的研究報(bào)道。

2.灌注式生物反應(yīng)器系統(tǒng)

灌流式培養(yǎng)是目前的研究熱點(diǎn)之一。它的特點(diǎn)是不斷地加入新鮮培養(yǎng)基并不斷地抽走含細(xì)胞代謝廢物的消耗培養(yǎng)基，使細(xì)胞得以在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)環(huán)境內(nèi)增殖，既省時(shí)省力，又減少了細(xì)胞發(fā)生污染的機(jī)會(huì)，且可以提高細(xì)胞密度10倍以上。

3.旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)

近年來(lái)，旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器系統(tǒng)（RCCS）已經(jīng)成為應(yīng)用微載體技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞大規(guī)模擴(kuò)增的一種較常用的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)是基于美國(guó)航空航天局為模擬空間微重力效應(yīng)而設(shè)計(jì)的一種生物反應(yīng)器。RCCS既可以用于微載體大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，又能用于培育細(xì)胞與支架形成的三維空間復(fù)合體。至今，已有近百種組織細(xì)胞在該系統(tǒng)內(nèi)成功進(jìn)行了大規(guī)模擴(kuò)增。

（五）微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)

微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

（1）表面積與體積比（S／V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高；

（2）把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點(diǎn)；

（3）可用簡(jiǎn)單的顯微鏡觀察細(xì)胞在微載體表面的生長(zhǎng)情況；

（4）簡(jiǎn)化了細(xì)胞生長(zhǎng)各種環(huán)境因素的檢測(cè)和控制，重現(xiàn)性好；

（5）培養(yǎng)基利用率較高；

（6）容易放大；

（7）細(xì)胞收獲過程不復(fù)雜；

（8）勞動(dòng)強(qiáng)度小；

（9）培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間小。

知識(shí)拓展

Cytodex^TM細(xì)胞培養(yǎng)微載體技術(shù)

在微載體細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中，貼壁動(dòng)物細(xì)胞在懸浮于生物反應(yīng)器培養(yǎng)液內(nèi)的球形微載體表面上貼壁生長(zhǎng)。與轉(zhuǎn)瓶和細(xì)胞工廠等傳統(tǒng)方法相比，微載體可以提供極高的表面積與體積比，因此成為一種極具吸引力的新型替代技術(shù)，用于各種規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)研究和工藝放大。

Cytodex1是通過用遍布于整個(gè)基質(zhì)的帶正電荷的DEAE基團(tuán)取代交聯(lián)葡聚糖而形成的，是一種通用的微載體。它適合于大多數(shù)已經(jīng)建立的細(xì)胞株，并可用于原代細(xì)胞和正常的二倍體細(xì)胞株中病毒或細(xì)胞產(chǎn)物的生產(chǎn)。圖1-56所示為在Cytodex1上生長(zhǎng)的豬腎細(xì)胞。

Cytodex3是通過化學(xué)交聯(lián)一個(gè)薄層的變性膠原蛋白到交聯(lián)葡聚糖基質(zhì)而形成的，它對(duì)于體外難以培養(yǎng)的細(xì)胞是首選的微載體，且特別適合于具有類表皮細(xì)胞形態(tài)的細(xì)胞。膠原表面層能夠被多種水解蛋白酶所消化，從而為微載體表面收獲細(xì)胞，同時(shí)保持最大的細(xì)胞活力和細(xì)胞膜完整性提供了可能性。這對(duì)于大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)工藝所需要的連續(xù)傳代步驟是非常關(guān)鍵的。

微載體培養(yǎng)技術(shù)可以用于幾乎任何類型的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)容器中。然而，為了從常規(guī)的微載體培養(yǎng)中獲得最大的細(xì)胞產(chǎn)量和生產(chǎn)率，最好使用具有有效的混合系統(tǒng)的培養(yǎng)設(shè)備，以提供均勻的培養(yǎng)環(huán)境、均一的微載體懸浮培養(yǎng)液和充足的氧氣供應(yīng)。此外，應(yīng)該避免高剪切力對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的傷害。圖1-57所示為1000 L發(fā)酵罐中脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的生產(chǎn)設(shè)備。

對(duì)于常規(guī)的、小規(guī)模微載體培養(yǎng)（幾升工作體積），一些供應(yīng)商已經(jīng)改良了含有磁力驅(qū)動(dòng)的攪拌棒或葉輪的玻璃旋轉(zhuǎn)容器，可以用于微載體實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模培養(yǎng)。

圖1-56　在Cytodex1上生長(zhǎng)的豬腎細(xì)胞

圖1-57　1000L發(fā)酵罐中脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的生產(chǎn)設(shè)備

New　Brunswick推出一次性攪拌式生物反應(yīng)器

圖1-58　一次性攪拌式生物反應(yīng)器

提起生物反應(yīng)器，大家腦海中浮現(xiàn)出的肯定是那種又大又重的罐子。其實(shí)，在最近幾年，一次性生物反應(yīng)器的應(yīng)用也越來(lái)越廣，逐漸被研發(fā)人員所接受。與重復(fù)使用的轉(zhuǎn)瓶或不銹鋼生物反應(yīng)器相比，這類生物反應(yīng)器有著明顯的優(yōu)勢(shì)，包括節(jié)省勞動(dòng)力和成本、運(yùn)行中可快速轉(zhuǎn)換等。為此，New Brunswick Scientific（Eppendorf旗下公司）也推出了一次性的CelliGen BLU攪拌式生物反應(yīng)器（圖1-58）。這種全新的反應(yīng)器綜合了一次性技術(shù)以及傳統(tǒng)攪拌罐的可靠性能和擴(kuò)展性。CelliGen BLU使用了5.0L和14.0L的可替換的一次性攪拌罐體，能用于高密度動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。罐體包括攪拌槳、管道和過濾器。罐體的頂板上還帶有RTD溫度傳感器、pH和溶解氧探頭。控制套件具有符合cGMP生產(chǎn)要求的高級(jí)系統(tǒng)控制功能。

一次性罐體與傳統(tǒng)生物反應(yīng)器相比最大的優(yōu)點(diǎn)就是避免了滅菌、清洗和組裝，減少了污染風(fēng)險(xiǎn)，也減少了驗(yàn)證的需求，節(jié)省了時(shí)間和成本。

思考題

1.大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特性有哪些？

2.簡(jiǎn)述微載體培養(yǎng)的原理。