在組織工程的應(yīng)用過程中，常常要研究各種外界因素對細胞形態(tài)變化及生長的影響。由于體內(nèi)環(huán)境異常復(fù)雜，對體外培養(yǎng)的細胞進行外界刺激干預(yù)是研究細胞生理、病理現(xiàn)象的一種重要手段。

一、電

電刺激對細胞的生長、增殖、黏附等有明顯的影響。目前對體外培養(yǎng)細胞進行電刺激方法主要有采用導(dǎo)電聚吡咯膜或用電刺激儀直接刺激。

1．導(dǎo)電聚吡咯膜　聚吡咯膜是一種新型高分子材料，已先后應(yīng)用于促神經(jīng)再生、促組織創(chuàng)傷修補和人工臟器替代等方面，得到了國內(nèi)外學(xué)者廣泛的重視和研究。其具體步驟如下。

（1）聚吡咯膜的制備：在電化學(xué)工作站中，以0．01mol／L對甲苯磺酸鈉為電解液，采用單池三電極系統(tǒng)電化學(xué)氧化法在孔徑為120目的不銹鋼微孔篩上氧化吡咯單體制備聚吡咯膜。制備條件為0．05mol／L吡咯單體濃度、500s聚合時間、10mA電流強度。將制備好的聚吡咯膜用導(dǎo)電銀膠連出導(dǎo)線，并以硅膠絕緣。將待刺激的細胞懸液種植于預(yù)先置入導(dǎo)電聚吡咯膜的24孔細胞培養(yǎng)板中，每孔種植1．5ml細胞懸液。

（2）電刺激：在培養(yǎng)液中插入不銹鋼鋼絲為對電極，Ag／AgCl絲為參比電極，每2d給予2h，100mV恒電壓的通電刺激。分析檢測電刺激對細胞的影響。

2．電刺激儀刺激　在無菌操作臺，用常規(guī)1寸不銹鋼銀柄針灸針安裝固定在30mm×30mm的培養(yǎng)皿底部，再將0．01%多聚賴氨酸加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿加1ml；將培養(yǎng)皿置于37℃恒溫箱過夜，次日除去皿內(nèi)所有多聚賴氨酸液，置超凈臺內(nèi)晾干備用。細胞接種培養(yǎng)一定時間后進行電刺激。刺激時采用多用電子治療儀，固定電極正負方向，給細胞進行電刺激，每天刺激2次，每次30min（脈沖幅度為：連續(xù)波形80～120mA，頻率20Hz），刺激1周左右后分析觀察電刺激對細胞的影響。

二、電　　磁

電磁場可直接影響細胞的生化和生理過程。用于生物學(xué)研究的高場強電磁輻射模擬源（有界波模擬源）對培養(yǎng)細胞進行干預(yù)是一種敏感的研究模型。電磁輻射模擬源是一個能產(chǎn)生類似于空中傳播的電磁脈沖的裝置，由高壓脈沖發(fā)生源、引線極板、產(chǎn)生高壓電場的平行終端設(shè)備組成，它可以產(chǎn)生一個橫行傳播的電磁脈沖。對培養(yǎng)細胞進行電磁干預(yù)的具體步驟是：

將待檢測細胞以1×106　ml的濃度接種至6孔板中（在每個孔中放置四片蓋玻片后并預(yù)先用多聚賴氨酸包被處理），在37℃、5%CO2下培養(yǎng)爬片。進行輻射時將培養(yǎng)板放在輻射裝置的上、下兩平行極板之間，當高壓脈沖啟動時，即可對爬片進行實驗。其實驗參數(shù)為：場強6×104　V／m，脈沖上升時間20ns，脈寬30μs，頻率包含0～100MHz。對爬片輻射2min，共計5個脈沖。在輻射后不同時間撈片，分析觀察電磁輻射對細胞的影響。

三、應(yīng)　　力

力學(xué)是組織工程和細胞工程的基礎(chǔ)之一，常常要研究機械力對細胞形態(tài)變化及生長的影響。人們提出了多種離體培養(yǎng)細胞的力學(xué)實驗方法，研制出不同類型和功能的實驗裝置，不僅可以定性地分析而且能定量地研究細胞的力學(xué)特性。以下介紹兩種常用細胞力學(xué)實驗方法：

1．基底拉伸法　可采用美國Flexercell公司生產(chǎn)的細胞拉伸加載裝置Flexercell 3　000Cell　Stretching　Unit。該裝置加載原理是用一個真空泵抽吸由特制彈性硅膠膜制成的培養(yǎng)皿底部，形成負壓使培養(yǎng)皿底部產(chǎn)生拉伸變形，從而使附底生長的細胞受到機械牽張。細胞所受力值大小以培養(yǎng)皿底部硅膠膜拉伸變率（%）表示，拉伸率越大，表示細胞所受張應(yīng)力越大。將待測細胞隨機分組，每組并設(shè)立對照。加力時可設(shè)定不同的力值大小如6%、12%和24%等，加力時間可根據(jù)實驗需要而定（如24h）。

2．流體剪切法　流室系統(tǒng)由兩塊有機玻璃平板和環(huán)行硅橡膠墊圈組成。硅橡膠墊圈夾于兩塊平板之間，可以防止?jié)B漏，并決定流場的性質(zhì)。安裝后流室的尺寸為：長8．5cm，寬2．5cm，高0．3mm。流入孔和流出孔間距離為7．0cm。流室測試區(qū)可滿足層流、二維流動、充分發(fā)展流動。

將待測細胞接種到載玻片（7．5cm× 2．5cm）上，待長滿匯合后轉(zhuǎn)移到流室的測試區(qū)。密封后進行流體剪切試驗。用蠕動泵作為實驗中的灌流系統(tǒng)提供穩(wěn)定的定常流。根據(jù)實驗需要，選取不同檔的切應(yīng)力處理細胞不同時間（如1h或2h）。流室內(nèi)保持37℃恒溫，整個灌流系統(tǒng)處于同一水平面。

四、生 長 因 子

生長因子（growth　factor，GF）是具有誘導(dǎo)和刺激細胞增殖、維持細胞存活等生物效應(yīng)的蛋白類物質(zhì)，其對促進細胞增殖、組織或器官的修復(fù)和再生都具有重要的促進作用，是組織工程的重要影響因素之一。目前組織工程領(lǐng)域研究和應(yīng)用的一些重要生長因子有骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone　morphogenetic　protein，BMP）、堿性成纖維細胞生長因子（basic　fabroblast　growth　factor，bFGF）、胰島素樣生長因子（insulin－like　growth　factor，IGF）、血管內(nèi)皮細胞生長因子（vascular　epithelial　growth　factor，VEGF）、表皮生長因子（epidermal　growth　factor，EGF）、神經(jīng)膠質(zhì)生長因子（glial　growth　factor，GGF）、血小板衍化生長因子（platelet－deriv　edgrowth factor，PDGF）、角朊細胞生長因子（keratinocyte　growth　factor，KGF）等。生長因子的效應(yīng)與生長因子的來源、濃度、劑量和種子細胞來源、分化狀態(tài)、培養(yǎng)條件及有無其他生長因子參與等多種因素有關(guān)。對細胞進行干預(yù)時需要進行反復(fù)實驗才能確定產(chǎn)生最佳效應(yīng)的各項條件。

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)部　白曉春）

參　考　文　獻

1　郭葆玉 ．細胞分子生物學(xué)實驗操作指南 ．上海：第二軍醫(yī)大學(xué)出版社，1998：107－115

2　D．L．斯佩克特，R．D．戈德曼，L．A．萊因萬德著，黃培堂等譯 ．細胞實驗指南 ．北京：科學(xué)出版社，2001：1－32

3　伍欣星，聶　廣，胡繼鷹 ．醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)原理與方法．北京：科學(xué)出版社，2000：369－372

4　程寶鸞 ．動物細胞培養(yǎng)技術(shù) ．廣州：華南理工大學(xué)出版社，2000：8－112

5　李志勇．細胞工程　．北京：科學(xué)出版社，2003：85－103

6　辛　華 ．細胞生物學(xué)實驗 ．北京：科學(xué)出版社，2001：97－126

7　鄂　征 ．組織培養(yǎng)和分子細胞技術(shù) ．第4版．北京：北京出版社，2001：1－32

8　J．薩姆布魯克，D．W．拉塞爾著，黃培堂等譯．分子克隆實驗指南 ．第3版 ．北京：科學(xué)出版社，2002：1271－1313

9　F．奧斯伯，R．E．金斯頓戈德曼，J．G．塞德曼等著，顏子穎，王海林譯 ．精編分子生物學(xué)實驗指南．北京：科學(xué)出版社，1998：274－289

10 王征美，楊　鍵，盧榮華等 ．中樞神經(jīng)細胞培養(yǎng)中電刺激的實驗研究 ．中國康復(fù)理論與實踐，2002；8（11）：664－665

11 浦躍樸，李云暉，韓運雙等 ．大鼠角朊細胞導(dǎo)電聚吡咯膜原代培養(yǎng)法的建立 ．生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2001；18（3）：416－418

12 趙梅蘭，曹曉哲，王德文等 ．電磁輻射誘導(dǎo)乳鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的研究 ．中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志，2002；24（12）：743－746

13 白　靈，樊瑜波，張　明等 ．離體培養(yǎng)細胞的力學(xué)實驗方法．生物醫(yī)學(xué)工程雜志，2002；19（2）：324－328

14 侯　銳，毛天球 ．生長因子在組織工程中的應(yīng)用等．國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊，2002；25（5）：219－223

15Kwak　HJ，Lee　SJ，Lee　YH．Angiopoietin－l　inhibits　irradiations　and　mannitol－induced　apoptosis　in endothelial　cells．Circulation；2000：101：2317－2324