培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察_組織工程學(xué)實(shí)驗(yàn)技

一、活細(xì)胞觀察

細(xì)胞培養(yǎng)法允許實(shí)驗(yàn)者在細(xì)胞培養(yǎng)的不同階段，進(jìn)行觀察和紀(jì)錄活細(xì)胞的變化過程。最常用的觀察記錄方法是相差顯微鏡觀察和攝像。

培養(yǎng)的活細(xì)胞在一般顯微鏡下觀察時(shí)，細(xì)胞是透明的，反差小，難以觀察到細(xì)胞清晰結(jié)構(gòu)，只有應(yīng)用相差裝置的顯微鏡，才能使目的物與背景反差增強(qiáng)，能夠看清細(xì)胞的輪廓和一些微細(xì)結(jié)構(gòu)如線粒體、核仁、染色質(zhì)等（圖3－1）。

圖3－1　人成骨肉瘤細(xì)胞株MG－63體外培養(yǎng)的相差顯微鏡觀察　×150

相差顯微鏡的相差裝置或顯微鏡都由兩個(gè)主要部分組成：相差聚光器和相差物鏡。在每個(gè)相差物鏡的光學(xué)系統(tǒng)中都有一個(gè)光環(huán)透鏡；在聚光器里有數(shù)個(gè)可轉(zhuǎn)換的相位板，一定倍數(shù)的物鏡使用時(shí)須與相應(yīng)的相位板一致。相差觀察時(shí)對照明要求嚴(yán)格，光軸要對正，視野照明光度均勻。

【操作步驟】

1．先調(diào)好相位板，使聚光器相位板號與相差物鏡放大倍數(shù)相一致。

2．然后抽出目鏡，再換輔助望遠(yuǎn)鏡，移動輔助鏡筒并調(diào)整聚光器相位板，使視野中兩個(gè)大小一樣的光環(huán)必須相互吻合，如不同說明倍數(shù)不一致。

3．再重新?lián)Q上原目鏡，即成相差圖像，可進(jìn)行觀察和攝影；當(dāng)更換不同倍數(shù)物鏡時(shí)，須按上述過程重新調(diào)節(jié)。

【注意事項(xiàng)】

（1）對培養(yǎng)瓶、皿的要求。相差顯微鏡觀察要求底物要平坦、質(zhì)地均勻、透光度好；一般玻璃瓶凹凸不平不適做相差觀察和攝影。最好用質(zhì)地均勻的塑料培養(yǎng)瓶。

（2）觀察和攝像前要擦凈培養(yǎng)瓶面，勿使殘留污跡影響透光度。

（3）調(diào)光。對正光軸是顯微攝影的重要條件，忽視時(shí)不易獲得理想效果。

二、化學(xué)染色觀察

培養(yǎng)細(xì)胞既可直接觀察活細(xì)胞，也可進(jìn)行固定制成永久標(biāo)本進(jìn)行染色觀察。固定染色觀察是細(xì)胞培養(yǎng)中常用顯示細(xì)胞形成的技術(shù)，能揭示細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)細(xì)胞可用各種方法染色，有一般和特殊之分。一般化學(xué)染色觀察為觀察細(xì)胞一般形態(tài)之用，如常用的Giemsa染色、蘇木精－伊紅（HE）染色法等；特殊染色為用于觀察細(xì)胞的特殊成分和結(jié)構(gòu)的方法，如酶細(xì)胞化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)方法等。以下介紹培養(yǎng)細(xì)胞的一般化學(xué)染色觀察方法。

（一）細(xì)胞培養(yǎng)物固定前的處理

各種細(xì)胞材料如蓋片單層培養(yǎng)物（細(xì)胞爬片）、懸浮培養(yǎng)物等都可進(jìn)行細(xì)胞固定。蓋片條從培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中取出后經(jīng)Hanks液漂洗多次，洗去血清和附著于細(xì)胞表面的死細(xì)胞殘?jiān)?。懸浮?xì)胞經(jīng)低速離心去除血清，再用Hanks液清洗后，制成涂片，空氣干燥。

（二）細(xì)胞固定

細(xì)胞固定的目的在于迅速終止組織內(nèi)種酶的活性，防止細(xì)胞自溶，保持細(xì)胞完整的形態(tài)結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)和酶能準(zhǔn)確定位。常用的固定試劑為甲醇、乙醇、丙酮、冰醋酸、甲醛、戊二醛、重鉻酸鉀、鋨酸等，分別以不同的劑量單用或混合配制。以下為常用的幾種固定液：

1．10%甲醛溶液　甲醛100ml，蒸餾水900ml。

2．10%中性甲醛（pH　7．2）　0．2mol／L Na2HPO472ml，0．2mol／L　NaH2PO428ml，甲醛20ml，加雙蒸水至200ml。

3．甲醇／冰醋酸固定液　甲醇∶冰醋酸＝3∶1。

4．Carnoy固定液　無水乙醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml。

5．4%多聚甲醛　先配緩沖液：0．2mol／L Na2HPO472ml，0．2mol／L　NaH2PO428ml，加雙蒸水至200ml。然后將緩沖液加溫至30～60℃，加入多聚甲醛2g，攪拌，滴加2mol／L　NaOH使溶解，再以1mol／L　HCl調(diào)pH至7．2。

培養(yǎng)細(xì)胞層次少，固定液穿透快，固定效果好，固定所需時(shí)間短，一般只需5～10min即可。

（三）Giemsa細(xì)胞染色法

Giemsa染色是最常用的方法，它簡便、快速，適用于多種細(xì)胞和染色體染色。

【操作步驟】

1．Giemsa染色液配制　稱Giemsa粉0．5g、甘油22ml，在研缽內(nèi)先用少量甘油與Giemsa充分混合，研磨至無顆粒；再將剩余甘油混在一起，56℃保溫2h后，加入33ml甲醇，保存于棕色瓶內(nèi)。臨用時(shí)按1∶9比例取Giemsa染色液與pH　7．0磷酸鹽緩沖液混合配成Giemsa應(yīng)用液。

2．染色步驟　細(xì)胞標(biāo)本清洗→甲醇固定10min→空氣干燥→滴加染色液布滿玻片染15min→流水沖洗3min→空氣干燥→中性樹膠封片→觀察與攝影。

3．結(jié)果　胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色（圖3－2，彩圖1）。

圖3－2　體外培養(yǎng)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的Giemsa染色觀察　×150

【注意事項(xiàng)】

1．染色時(shí)染色液應(yīng)布滿玻片，不要有氣泡；固定后，玻片一定要干燥后染色，否則殘留固定液會使局部淺染、不染或染成褐色。

2．應(yīng)用染色液宜現(xiàn)配現(xiàn)用，保存時(shí)間最好不要超過48h。

3．Giesma對pH極敏感，磷酸鹽緩沖液pH值要調(diào)準(zhǔn)確；染色后的標(biāo)本一定要干燥后再封片，否則中性樹膠封片后，殘留的水與膠作用，標(biāo)本局部呈現(xiàn)乳白色渾濁。

4．染色完畢，不能先倒去染料后沖洗，因?yàn)槿旧罕砻娉Ｐ纬梢粚友趸ぃ粝鹊谷ヒ后w，氧化膜易附著片上形成污渣，不易被水沖掉，結(jié)果細(xì)胞和背景都不清晰，正確方法是：小量流水從玻片一端流下，染料漂起隨流水沖走。

（四）蘇木精－伊紅染色

【操作步驟】

1．染色液配制

（1）蘇木精染液（Mayer）：取1g蘇木精溶于1000ml熱蒸餾水中→加入鉀明礬50g、碘酸鈉0．2g，攪拌至溶→加入水合氯醛50g，檸檬酸1g，加入至沸騰5min→冷卻后過濾，次日即可用。

（2）1．0%伊紅染液配方：將1．0g伊紅（水溶性）溶于100ml蒸餾水中。

2．染色步驟　細(xì)胞單層培養(yǎng)物漂洗→固定→蘇木精染色5～10min→自來水漂洗→浸入稀鹽酸乙醇液（用75%乙醇與1%鹽酸配制）數(shù)秒后進(jìn)行分色處理。脫去多余的藍(lán)浮色，使核呈深藍(lán)色，胞質(zhì)無色或呈灰藍(lán)色→自來水浸洗→淡氨水（400ml自來水加2滴氨水）沖洗10min以上，使細(xì)胞核藍(lán)化→自來水浸洗→1%伊紅染色液染5～10min，進(jìn)行對比染色→用蒸餾水洗去玻片上的浮色→70%、80%、90%梯度乙醇脫水一次，再經(jīng)95%、100%乙醇脫水兩次，每次1min，浸入二甲苯兩次，每次1min，樹膠封固→觀察。

3．結(jié)果　光鏡下細(xì)胞核呈深藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)粉紅色（圖3－3，彩圖2）。

圖3－3　體外培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞的H．E．染色觀察　×100

三、超微結(jié)構(gòu)觀察

培養(yǎng)細(xì)胞具有層次薄和材料新鮮的特點(diǎn)，固定時(shí)很容易穿透，固定效果很好，適于做電鏡觀察，以下分別介紹培養(yǎng)細(xì)胞的透射電鏡與掃描電鏡觀察。

（一）透射電鏡觀察

【試劑】　2%～3%瓊脂糖，戊二醛，75%乙醇，1%四氧化鋨，pH7．2～7．4PBS緩沖液。

【操作步驟】

1．細(xì)胞懸液標(biāo)本制備

（1）收集5×107／ml左右對數(shù)生長期細(xì)胞（在收集前一天換液一次）連同培養(yǎng)基一起置2ml塑料小管中，用Hanks液或PBS液清洗2～3次，1　000～1　500g離心10min，去上清液。

（2）沿著管壁加入2%～3%戊二醛，輕輕吹打，使細(xì)胞混懸于固定液中，4℃固定30min，用小鋁片將細(xì)胞團(tuán)塊鏟離管底，翻面繼續(xù)用新固定液固定30min或更長時(shí)間，1　000g離心5min，去上清液。

（3）4℃PBS液沖洗，沖洗時(shí)間不等，一般為1～2h或過夜，離心后去上清液。

（4）離心管內(nèi)加入0．1～0．5ml　2%～4%瓊脂糖液（37℃），兩手搓離心管，使細(xì)胞與瓊脂糖液混勻，室溫下冷卻，形成細(xì)胞瓊脂凝膠預(yù)包埋塊。

（5）離心管內(nèi)加適量PBS液或75%乙醇，用鋁片沿管壁輕輕地將細(xì)胞瓊脂糖凝膠塊松動，將其移入含75%乙醇的青霉素瓶內(nèi)，24h后換固定液一次，4℃保存，1年內(nèi)使用。

（6）預(yù)包埋塊切成1mm3大小，置1%四氧化鋨4℃固定1～2h。PBS液反復(fù)漂洗。

（7）分別用50%、70%、90%丙酮脫水一次，每次10～15min；100%丙酮脫水3次，每次30min。

（8）浸入稀釋包埋劑中（丙酮∶包埋劑＝1∶1），室溫1h；再浸入純包埋劑（如環(huán)氧樹脂）37℃過夜。60℃固化48h。干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

（9）常規(guī)電鏡樣品超薄切片，鈾鉛染色及透射電鏡觀察，具體方法請參照相關(guān)文獻(xiàn)，因篇幅有限，這里不再贅述（圖3－4）。

2．細(xì)胞蓋片標(biāo)本制備

（1）將生長在蓋玻片或聚苯乙烯蓋片上的單層細(xì)胞取出，置青霉素瓶內(nèi)，用4℃PBS液漂洗3次。

（2）用2%冷的戊二醛固定30min，冷PBS液漂洗3次。

（3）用1%四氧化鋨固定30min。

（4）梯度丙酮脫水（50%、70%各1次，90%2次，100%3次）。

（5）浸入稀釋包埋劑3ml，室溫30min后換純包埋劑1ml，2h或過夜。

圖3－4　小鼠漿細(xì)胞的透射電鏡觀察×6　000

（6）將明膠囊裝滿混合包埋劑，倒蓋在單層細(xì)胞上，60℃固化2h。聚苯乙烯蓋片與包埋劑直接用手分離。而玻璃蓋片與包埋劑一齊放入盛液氮的燒杯內(nèi)片刻，迅速取出放在自來水中，二者即可分離。常規(guī)電鏡樣品超薄切片，鈾鉛染色及透射電鏡觀察。

（二）培養(yǎng)細(xì)胞掃描電鏡觀察

【試劑】　2%～3%戊二醛，pH7．2～7．4 PBS緩沖液，梯度乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%），1%四氧化鋨。

【操作步驟】

1．單層細(xì)胞蓋玻片培養(yǎng)物漂洗后，用2%～3%戊二醛4℃固定1h。PBS液洗3次，每次10min。

2．1%鋨酸固定1h，PBS液清洗3次，每次10min（鋨酸一定要除凈，因?yàn)殇~酸本身也發(fā)射電子，影響觀察）。

3．乙醇上行脫水（30%、50%、70%、80%、90%、95%），各濃度乙醇通過2次，每次15min。

4．95%乙醇保存或臨界點(diǎn)干燥后噴金，掃描電鏡觀察（圖3－5）。

圖3－5　體外培養(yǎng)細(xì)胞的掃描電鏡觀察　×2　000

四、免疫細(xì)胞化學(xué)觀察

免疫細(xì)胞化學(xué)（immunocytochemistry）是利用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的原理對組織細(xì)胞內(nèi)特定抗原進(jìn)行定性、定位和定量研究的一種技術(shù)。此技術(shù)需預(yù)先將某種標(biāo)記物結(jié)合到抗體上，借標(biāo)記物的熒光或酶的有色反應(yīng)、放射性或高電子密度，在光鏡或電鏡下進(jìn)行定性、定位或定量觀察。由于抗原抗體的結(jié)合是高度特異的，所以免疫細(xì)胞化學(xué)具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，定位準(zhǔn)確及應(yīng)用廣泛等特點(diǎn)。這里介紹利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法顯示培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)波形纖維蛋白。

膠原蛋白（collagen）在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中都有表達(dá)。使抗膠原蛋白的一抗與細(xì)胞內(nèi)的膠原蛋白結(jié)合，再使生物素標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，然后滴加辣根過氧化物酶（horseradish　peroxidase，HRP）標(biāo)記的親和素，后者與二抗結(jié)合，通過顯示HRP，最終顯示了膠原蛋白。

【實(shí)驗(yàn)用品】

1．器材　超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、滴管、吸管、移液管、培養(yǎng)皿、24孔培養(yǎng)板、試管架、恒溫水浴鍋、20μl微量加樣器。

2．試劑　PBS溶液（pH7．4）；一抗；免疫學(xué)檢測試劑盒；顯色試劑盒。

3．材料　培養(yǎng)細(xì)胞飛片。

【操作步驟】

1．培養(yǎng)細(xì)胞飛片取出后，Hanks液沖洗，4℃冷丙酮固定，干燥30min，用PBS溶液（pH7．4）沖洗3次，每次3～5min（3× 5min）。

2．每張切片加1滴3%H2O2溶液以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育0min。

3．PBS溶液沖洗（3×5min）。

4．每張切片加1滴非免疫性動物血清，室溫下孵育10min，減少非特異性背景，不必沖洗，只須吸去多余的液體。

5．每張切片加1滴第一抗體，室溫下孵育30min。入4℃過夜。

6．次日取出后，先在濕盒室溫下放置20～30min，然后PBS溶液沖洗（3×5min）。

7．每張切片加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體，37℃，30min。

8．PBS溶液沖洗（3×5min）。

9．每張切片加1滴抗親和素－HRP溶液，37℃，40min。

10．PBS溶液沖洗（3×5min）。

11．每張切片加1滴新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min。

12．自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。

【觀察結(jié)果】　細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯示棕黃色的部位即為膠原蛋白所在的部位（圖3－6，彩圖3）。

圖3－6　體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞膠原蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)觀察　×400