成纖維細(xì)胞是結(jié)締組織最主要的細(xì)胞成分，在分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分及構(gòu)建細(xì)胞外基質(zhì)中扮演著重要的角色，在組織創(chuàng)傷修復(fù)中也發(fā)揮著重要的作用。成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)的分裂增殖能力，是最容易培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞類型之一。

成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)目前比較成熟。常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊貼壁培養(yǎng)法和酶消化法。

一、材　　料

1．皮膚來源　一般采用外科手術(shù)切除下的包皮、乳房或腹部皮膚。如果不能馬上把標(biāo)本送入細(xì)胞培養(yǎng)室，可在培養(yǎng)液中4℃保存2～3d。

2．培養(yǎng)液

（1）成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液：DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、4mM谷氨酰胺以及100U／ml青霉素和100μg／ml鏈霉素。

（2）皮膚標(biāo)本儲(chǔ)運(yùn)液：DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg／ml鏈霉素、2．5μg／ml兩性霉素和50μg／ml慶大霉素。

3．其他培養(yǎng)用液

（1）PBS液：無鈣鎂磷酸鹽緩沖液，成分為1%（W／V）NaCl，0．025%KCl，0．144% Na2HPO4，0．025%KH2PO4，調(diào)整溶液的pH為7．2，高溫、高壓消毒滅菌，室溫下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

（2）胰蛋白酶－EDTA消化液：將0．25%的胰蛋白酶溶液和0．02%的EDTA溶液按1∶4（V／V）的比例配制。

（3）中性蛋白酶（dispase）液：用無血清DMEM培養(yǎng)基配制，濃度為2mg／ml，過濾消毒，即配即用。

（4）I型膠原酶溶液：用PBS液配制，濃度為0．1%，過濾消毒，即配即用。

4．培養(yǎng)器皿　培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿和各種手術(shù)用刀、剪等。

二、酶消化法原代培養(yǎng)

1．將外科手術(shù)切除下的皮膚置入皮膚標(biāo)本貯運(yùn)液中。

2．在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出標(biāo)本，在75%乙醇中快速浸洗3次。

3．用剪刀剪去皮下脂肪組織，并將標(biāo)本修剪成寬2～3mm的條狀。

4．用PBS漂洗2次，將皮片浸于中性蛋白酶（dispase）液中4℃過夜或37℃下消化2～4h。

5．從中性蛋白酶消化液中取出標(biāo)本，將其放入另一培養(yǎng)皿中，用兩把眼科鑷子將表皮與真皮分離開。

6．用眼科剪刀將真皮片剪碎，移入50ml離心管中。

7．加入0．1%的膠原酶溶液消化剪碎的真皮，37℃下振蕩4h左右。

8．待消化液已顯渾濁，停止消化。經(jīng)150目不銹鋼濾網(wǎng)過濾消化液，收集細(xì)胞懸液。

9．用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，依上述條件再離心1次。

10．用培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)。以（1．5～3）×104個(gè)細(xì)胞／cm2的密度接種到培養(yǎng)瓶或皿中。在37℃，5%CO2，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液3d換1次。一般原代培養(yǎng)10d左右細(xì)胞生長至75%融合時(shí)即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

三、組織塊法原代培養(yǎng)

1．重復(fù)酶消化法原代培養(yǎng)步驟1～5。

2．將真皮片轉(zhuǎn)移到裝有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，用眼科剪刀將真皮片剪切成1mm3的小塊。

3．用吸管將真皮植塊及少量培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶中。將真皮植塊按0．5cm左右的間距均勻放置在培養(yǎng)瓶底部生長面。小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織塊處于“懸滴”狀態(tài)，擰緊瓶蓋，在37℃，5%CO2，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中。

4．孵育培養(yǎng)4～6h后，將培養(yǎng)瓶取出，瓶底仍朝上。向瓶內(nèi)加入1～2ml培養(yǎng)液，慢慢翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液緩緩覆蓋真皮植塊，盡量防止植塊漂浮起來。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h。

5．檢查培養(yǎng)物，確認(rèn)植塊已經(jīng)黏附于培養(yǎng)瓶底部后，再加入適量培養(yǎng)液，以后培養(yǎng)液每3～5d換1次。

6．在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)物，當(dāng)遷出的成纖維細(xì)胞匯合成片、覆蓋大約75%的生長面時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

四、傳代培養(yǎng)

1．用吸管吸盡培養(yǎng)液。對于組織塊培養(yǎng)，先要用鑷子或吸管取出植塊。然后用PBS液沖洗2次。

2．加入胰蛋白酶－EDTA消化液，液量以剛能覆蓋培養(yǎng)瓶底部即可，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。3～5min后，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)大部分細(xì)胞開始收縮變圓時(shí)，慢慢傾斜培養(yǎng)瓶，用吸管吸去消化液。

3．加入含血清的培養(yǎng)液終止胰蛋白酶的消化作用。用吸管吸取培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞與瓶底分離，并分散為單個(gè)細(xì)胞懸液。

4．苔盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要用培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。在單純細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)，可直接以1∶3或1∶4的比例進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。培養(yǎng)液3d換1次，細(xì)胞生長至75%融合時(shí)再進(jìn)行傳代。

（上海第二醫(yī)科大學(xué)第九人民醫(yī)院　崔　磊　楊光輝）