三、轉(zhuǎn)基因動物的檢測方法

轉(zhuǎn)基因動物的基因組是否帶有外源基因可以通過PCR反應(yīng)進(jìn)行快速篩選，并進(jìn)一步用southern blotting確證，陽性轉(zhuǎn)基因個體可進(jìn)一步檢測表達(dá)產(chǎn)物、表達(dá)量以及可能的生物學(xué)活性。

（一）基因重組子構(gòu)件功能的檢測

轉(zhuǎn)基因動物所用基因重組子是否能夠特異表達(dá)以及表達(dá)水平的高低可以事先在體外或體內(nèi)進(jìn)行驗證。

體外驗證可以通過組織特異分泌表達(dá)的特點進(jìn)行，如在制備乳腺特異表達(dá)的生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)基因動物前，先將外源基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞，合適條件下乳腺細(xì)胞應(yīng)該表達(dá)和分泌外源蛋白，如此即可驗證構(gòu)建的基因重組子表達(dá)載體的功能，以減少不必要的人力、物力和財力的浪費。

體內(nèi)方法可以直接將構(gòu)建好的基因重組子用注射器或基因槍注入到乳腺組織中，也可以通過血管或尾靜脈注射動物，定時按照設(shè)計要求采集乳汁、血樣、尿樣或精液等用來檢測外源基因的表達(dá)情況及表達(dá)水平，以確定構(gòu)建的重組子構(gòu)件的功能是否按照設(shè)計的功能進(jìn)行。體內(nèi)檢測還可以通過誘導(dǎo)泌乳或誘導(dǎo)性早熟等手段對陽性轉(zhuǎn)基因動物進(jìn)行處理，使乳腺或性腺等提前發(fā)育，通過誘導(dǎo)分泌的乳汁或誘導(dǎo)早熟的精液檢測外源基因的表達(dá)，可以提前檢測到轉(zhuǎn)基因動物是否按照設(shè)計的方案表達(dá)外源基因，以減少昂貴的動物飼養(yǎng)費用。

（二）外源基因整合的檢測

從“轉(zhuǎn)基因”動物細(xì)胞或組織取樣，抽提基因組DNA，利用外源基因的特異PCR引物進(jìn)行快速PCR檢測，PCR陽性的動物再從基因組DNA進(jìn)行Southern雜交印跡分析，陽性雜交結(jié)果基本可以認(rèn)為是整合了外源基因的轉(zhuǎn)基因動物。

（三）基因表達(dá)的檢測

外源基因的表達(dá)與否可以在RNA和蛋白質(zhì)兩個水平上進(jìn)行檢測，RNA水平的檢測，抽提轉(zhuǎn)基因動物特定組織或細(xì)胞的mRNA，通過Northern印跡方法或RT－PCR方法檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)是否發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。蛋白質(zhì)水平則可以通過檢測特定組織或細(xì)胞中是否有外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，常用的方法包括Western blotting、ELISA或放射免疫測定，高表達(dá)的基因產(chǎn)物還可以通過SDS－PAGE進(jìn)行檢測甚至定量。

（四）應(yīng)用報告基因

從實驗研究的角度，為了檢測的直觀和方便，外源基因通常采用報告基因來代替目的基因，這對于研究一個技術(shù)平臺是非常有用的。常用的報告基因包括：β^－半乳糖苷酶基因（β^－gal）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、熒光素酶基因等。近年來開發(fā)和廣泛使用的綠色熒光蛋白基因是一個被廣為采用的報告基因，綠色熒光蛋白（GFP）是水母中分離到的一種蛋白質(zhì)（238個氨基酸殘基，分子量30×10³），活體GFP與離體GFP一樣，在藍(lán)光的激發(fā)下能產(chǎn)生綠色熒光，可以用紫外、熒光分光光度計或熒光顯微鏡進(jìn)行活體觀測，被廣泛用于原核和真核生物轉(zhuǎn)基因的報告基因。