第二節(jié)　單克隆抗體技術

1975年Kohler和Milstein創(chuàng)立了生產單克隆抗體（簡稱單抗）的淋巴細胞雜交瘤技術。這項技術的誕生推動了整個生物醫(yī)學領域的迅速發(fā)展。單抗作為抗原物質的分子識別工具除在生物醫(yī)學基礎研究、免疫和治療方面得到廣泛應用外，在疫病診斷和檢疫中正在并將繼續(xù)發(fā)展重要作用。

一、基本原理

作為抗體生成理論的克隆選擇學說是雜交瘤技術產生的理論依據，細胞融合技術和雜交細胞的選擇方法是雜交瘤技術產生的技術基礎。

（一）克隆選擇學說

1957年Burnet提出的克隆選擇學說認為：每一個B淋巴細胞有一個獨特的受體（現在認為一個B淋巴細胞，產生與受體特異性相同的抗體分子）。一個淋巴細胞只產生一種抗體分子。因此，根據克隆選擇學說，一個B淋巴細胞克隆只能產生一種抗體分子。這就是生產單克隆抗體的理論依據。

（二）抗體多樣性能的分子基礎

抗體分子生物學的研究為克隆選擇學說提出了新的依據?？贵w分子是對稱的，由兩條完全相同的糖基化重鏈（H）和兩條完全相同的非糖基化輕鏈（L）組成。根據重鏈穩(wěn)定區(qū)（C_H）的不同，免疫球蛋白（Ig）可分為IgM、IgD、IgG、IgE和IgA五類，它們分別帶有μ、δ、γ、ε和α重鏈，又可進一步分為不同的亞類。重鏈和輕鏈均有一個可變區(qū)，分別用V_H和V_L表示，決定抗體的特異性。每個抗體分子只有一種輕鏈。重鏈和輕鏈可變區(qū)具有抗原結合部，決定抗體的特異性。每個抗體分子都有兩個相同的抗原結合部。對抗體基因的研究表明：重鏈和K鏈V區(qū)基因的數目分別為250個左右。任意一個V_K基因片段可以與任意一個J_K基因片段結合（J基因為連接基因）。J_K有4片段，故可產生1000（250×4）個不同的V_K區(qū)編碼基因。同樣，任意一個V_H基因片段可以與任意一個D基因片段（D基因為多樣性基因，在V_H和J_H基因之間，約有12個）及J_H基因片段結合。這樣可產生10000（250×10×4）個不同的重鏈V區(qū)編碼基因。重鏈與輕鏈的聯(lián)合是隨機的，因此可產生10⁷（1000×10000）個特異性抗體。此外，輕鏈和重鏈基因重排時的移碼、重鏈D基因5’端和3’端的修剪及隨機延伸，不可產生多樣性，因此特異性抗體的數目多得幾乎是無限的。

（三）細胞融合、篩選和雜交瘤技術的建立

腫瘤細胞DNA生物合成有兩條途徑：一條由糖、氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA，這是主要途徑。這條途徑可被葉酸拮抗物——氨基喋呤（A）所阻斷。但如果培養(yǎng)基中含核苷酸“前體”次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷，即便有A存在，細胞通過另一途徑（稱替代途徑或應急途徑）也可合成核苷酸。但后一途徑需次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉化酶（HGRPT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）存在。

一些骨髓瘤細胞系在體培養(yǎng)過程中常常失去生產重鏈能力，甚至既不生產重鏈，也不生產輕鏈。有的還可喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶的能力。但在自然變異中，這種HGRPT（－）細胞在群體中只有百萬分之幾。如果在培養(yǎng)基中加入8－氮鳥嘌呤（8－AG）或瘤細胞系SP2/0、NS－1和X₆₃/Ag－8（都是人工篩選的8－AG細胞），則在含氨基喋呤（A）的選擇培養(yǎng)基中因DNA所有生物合成途徑被阻斷而死亡，但雜交細胞得到另一親本（如脾細胞）的HGPRT，則可通過那條應急途徑利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成DNA而得以生存下來。由此，可將雜交瘤細胞篩選出來。

Kohler和Milstein將HGPRT（－）骨髓瘤細胞與經綿羊紅細胞免疫的Balb／c動物脾細胞通過仙臺病毒介導進行融合，在含次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的選擇培養(yǎng)基（HAT）中進行培養(yǎng)。結果未融合的骨髓瘤細胞因無HGPRT和A的阻斷而死亡，未融合的脾細胞因不具備連續(xù)培養(yǎng)特性也死亡，只有骨髓瘤細胞與脾淋巴細胞形成的雜交瘤細胞因得到HGPRT酶并具備連續(xù)培養(yǎng)特性而生存下來。所獲得的雜交瘤細胞經過克隆純化后，具有能穩(wěn)定分泌抗綿羊紅細胞抗體的能力，注射動物能產生腫瘤，其腹水和血清含有高效價的同質抗體。由于該項技術的創(chuàng)立對生物醫(yī)學做出了重大貢獻，作者榮獲1984年度諾貝爾生理和醫(yī)學獎。

（四）單克隆抗體與多克隆抗體的本質區(qū)別

如上所述，單克隆抗體是源于一個B淋巴細胞的雜交瘤細胞分泌的針對抗原的同一表位的抗體；而多克隆抗體（簡稱多抗）是由免疫動物的無數不同的B淋巴細胞分泌的針對抗原不同表位的性質各異的混合抗體。單抗是同質的，多抗是異質的。把握單抗與多抗的這些重要區(qū)別，對于正確應用這兩類抗體是十分重要的。

二、單克隆抗體技術的發(fā)展

自1975年建立該項技術以來，目前已取得新的重要進展，主要是：

（一）融合技術　除用聚乙二醇融合劑外，發(fā)展了融合、激光融合和定向融合技術。用FOX系骨髓瘤細胞與R_b8－12Balb/c動物脾細胞融合，存活的雜交瘤細胞均能分泌抗體。有的細胞生長因子可促進瘤細胞生長，在融合和克隆時把它加進培養(yǎng)液中，可不加飼養(yǎng)細胞，并能提高融合率、克隆成活率和陽性率。

（二）發(fā)展了異源和非鼠源雜交瘤　用動物骨髓瘤細胞與其他動物（如兔、牛、豬、綿羊等）脾細胞融合，獲得異源雜交瘤。但融合率低，穩(wěn)定性差。近年來報道了雞和豬骨髓瘤細胞系研究成功，為研究雞和豬源單抗準備了前提條件。

（三）發(fā)展了雙特異性抗體　這是兩種分泌不同單抗的雜交瘤細胞間融合產生的雜交瘤。其方法是先研制對HAT敏感的親本雜交瘤細胞，然后與另一雜交瘤細胞融合，篩選。篩選出的雜交瘤分泌的單抗為雙特異性。如單抗的一臂結合過氧化物酶，另一臂結合抗原，省去標記酶的過程。

（四）發(fā)展了嵌合抗體、重構抗體和小分子抗體　嵌合抗體是應用重組DNA技術對抗體基因進行置換，從而改變原來抗體性質。如用編碼HRP或AP酶基因取代鼠單抗C區(qū)基因，表達產物既具有抗體活性，又具有酶活性。再如將毒素分子的編碼基因與單抗V區(qū)基因拼接，表達產物即為免疫毒素，可特異地殺傷靶細胞。重構抗體是將動物單抗中與抗原決定簇互補的結構，即互補性決定區(qū)（CDR）基因取代人抗體可變區(qū)的CDR基因，表達具有動物單抗特異性的入源抗體。通過DNA重組技術可以得到大小為完整IgGl/3的F_ab片段、為完整IgGl/6的只由重鏈可變區(qū)構成的單鏈抗體以及為完整IgG分子1/12的只有V_H區(qū)的單域抗體。

免疫球蛋白與抗原的結合主要決定于重鏈，輕鏈作用差些。一些不同特異性的抗體的V_L區(qū)很相似。因此抗體基因庫中V_H基因與有限數目的V_L基因排列組合可以構成任何需要的抗體。抗體基因工程可按人的需要構建新的抗體分子，將從根本上改變領先免疫獲得抗體的狀況。

三、單克隆抗體的應用

自1975年Kohler和Milstein報道，通過細胞融合建立能產生單克隆抗體的雜交瘤技術以來，這個最基礎的具有開創(chuàng)性的理論在生物科學的基礎研究以及醫(yī)學、預防醫(yī)學、農業(yè)科學等領域的廣泛的實踐，充分顯示它對生命科學各領域產生的巨大而深遠的影響。由于單抗有著免疫血清或抗體無法比擬的優(yōu)點，迄今全世界已研制成數以千計的單抗，有的已投入市場，有的正在進行應用考核和深入觀察。

（一）在診斷學中的應用　單抗應用最廣泛的是診斷，主要用于病原診斷，病理診斷和生理診斷，隨著微生物學、寄生蟲學、免疫學的研究進展，人類對感染性和寄生蟲性疾病有了新的認識，一個病原體存在許多性質不同的抗原，在同一抗原上，又可能存在許多性質不同的屬、種、群、型特異性抗原，采用雜交瘤技術，可以獲得識別不同抗原或抗原決定簇的單抗，從而可以對感染性疾病和寄生蟲病進行快速準確的診斷，同時可以用于調查疾病流行情況，流行毒株或蟲株分類鑒定，為病原的防疫治療提供資料。目前應用單抗診斷試劑診斷的人、畜禽、植物等病毒、細菌或寄生蟲病已有上百種，其中乙肝、狂犬病、乙型腦炎等人獸共患病30余種；雞新城疫、馬立克氏、豬瘟等畜禽病20余種；植物病毒病10余種；人、畜禽細菌病20余種；弓形蟲、瘧疾、旋毛蟲等寄生蟲病30余種。另外，單抗還成功應用于含量低微的激素、細菌毒素、神經遞質的腫瘤細胞抗原的診斷。

（二）單抗應用于臨床治療　用單抗治療腫瘤是醫(yī)學界寄予厚望的一項研究，目前已研制了的腫瘤單抗有：胃腸道腫瘤、黑色毒瘤、肺癌等數十種，用單抗可能的治療途徑是采用高親和并特異的單抗，偶聯(lián)藥物或毒素后（生物導彈）以定向殺傷腫瘤，目前該研究在實驗動物中已獲得成功，而單獨使用單抗治療人類惡性腫瘤獲得成功的例子國外也有報道。使用單抗治療畜禽傳染病，尤其是病毒病如雞傳染性法氏囊，成效十分顯著。近年來采用基因工程技術將抗體基因轉入植物可以生產大量的單抗，另外具有不同用途的嵌合抗體、人源單抗、重構抗體、小分子抗體的出現，為應用單抗治療各類疾病拓寬了道路。

（三）單抗是生物學研究的有力工具　目前，單抗已廣泛應用于不同學科，其中一部分是為基礎理論研究服務的，在病原方面可用于分類、分型和鑒定毒株，可用于探查抗原結構以及用于抗感染免疫機制和中和抗原的研究，結合分子生物學方法，可以確認病毒抗原蛋白的編碼基因，基因突變和轉譯產物的加工、處理、組裝過程，從而進一步研制基因重組疫苗。作為一種特異的生物探針，通過單抗的免疫組化定位，研究細胞的生理功能和疾病的病因、發(fā)病機制，對激素和受體可采用單抗的免疫分析、免疫細胞的定位，大大促進了激素和受體結構與功能、激素作用機理以及內分泌自身免疫性疾病病因的研究進展，另外單抗已應用于神經系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、藥理學和系統(tǒng)發(fā)育學、畜牧育種及性別控制等學科的研究工作中，從而極大的推動了整個生物學科的發(fā)展。

四、試劑的配制

細胞融合和雜交瘤細胞培養(yǎng)用試劑的配制方法如下。

（一）RPMI－1640基礎培養(yǎng)液1000ml

用900ml三蒸水（或無離子水再經過雙蒸），通CO₂攪拌溶解。稱取1.8gNaHCO₃，用少量三蒸水溶解，邊攪拌邊加入RPMI－1640液中。補足1000ml，通過0.22μm濾膜正壓過濾除菌（用CO₂鋼瓶加壓），分裝，置30℃，菌檢48h，4℃存放。有效期不超過3個月。

用時現配，4℃下存放不超過1周，用于細胞融合和克隆化培養(yǎng)的全培養(yǎng)液，可將小牛血清增至20%。

（三）200ml（3%）L－谷氨酰胺溶液

加熱至50℃使全溶，0.22μm膜濾除菌，－20℃保存。

（四）雙抗溶液

溶于100ml滅菌三蒸水中，小量分裝，－20℃凍存。

（五）篩選小牛血清的方法　取一份生長旺盛的雜交瘤細胞（或骨髓瘤細胞），按有限稀釋法用不含血清的培養(yǎng)液稀釋成每毫升5個或100個細胞，按每孔0.1m1分種于不含飼養(yǎng)細胞的96孔板中。其中，一部分板孔加待試小牛血清，一部分板孔加已知優(yōu)良血清，每孔1滴（約0.025ml）。在37℃5%～7% CO₂溫箱中培養(yǎng)7d左右，計數每孔細胞克隆數并估測群落大小，按克隆細胞的相對成活率和生長速度評價血清優(yōu)劣。

（六）50%聚乙二醇（PEG）溶液　取約3gPEG（MW l520或4000）放入試管中，加蓋包有硫酸紙的棉塞，121℃0.069～0.075MPa，高壓滅菌10min。當融化的PEG溫度降至41℃左右時，加入等量的1640基礎培養(yǎng)液（已預熱至41℃左右，并用7.5% NaHCO₃調pH至8.2），用溫熱的吸管吹吸混拌均勻，按0.8ml/支分裝在安瓿中，放－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

（七）7.5% NaHCO₃溶液　取7.5g NaHCO₃溶于100ml三蒸水中，0.22μm膜濾除菌，分裝小瓶中，4℃保存。

（八）氨基喋呤（A）貯存液　取1.76ml A，加90ml三蒸水，滴加0.05ml NaOH助溶，待完全溶解后，加0.5mllmol/L HCl中和，補足100ml三蒸水，0.22/μm膜濾除菌，分裝4ml/瓶，－20℃保存。

（九）次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液　取136.1ml H和388ml T，加45℃～50℃三蒸水至100ml，使之溶解，0.22μm膜濾除菌，分裝4ml/瓶，－20℃保存。

（十）HT培養(yǎng)液　在完全培養(yǎng)液中按1%加HT貯存液。

（十一）HAT培養(yǎng)液　在完全培養(yǎng)液中分別按1%加A貯存液和HT貯存液。

（十二）8－氮鳥嘌呤貯存液　取200ml 8－氮鳥嘌呤加入1ml 1mol/L NaOH中，溶解后加三蒸水至100ml，0.22μm膜濾除菌，按4ml/瓶分裝，－20℃保存。

（十三）8－氮鳥嘌呤培養(yǎng)液　向全培養(yǎng)液中按1%加入8－氮鳥嘌呤，即為含20μg/ml的全培養(yǎng)液。

五、操作方法

（一）抗原制備

選用什么形式的抗原免疫動物？選用什么形式的抗原作篩檢抗原？這是研制單抗設計中需要著重考慮的策略。一般來說，免疫抗原越純，雜交瘤細胞的陽性率越高。某些抗原甚至不提純，雜交瘤細胞也有相當高的陽性率。應根據研究對象的具體情況和研究目的而定。研制病毒特異性單抗往往經密度梯度離心或層析純化過的病毒作免疫抗原和篩檢抗原。但用粗提或不提純的病毒抗原免疫動物也能獲得成功。如以新城疫病毒濃縮尿囊液或疫苗、馬立克氏病毒感染細胞的超聲波粉碎抗原、口蹄疫病毒和豬水皰病病毒聚乙二醇或硫酸銨濃縮抗原作免疫抗原、進行雜交瘤試驗，均曾獲得成功。研制細菌單抗往往用全菌或其裂解物作免疫抗原。研制抗原特定表位的單抗時需精心設計技術路線。如研制羊布氏菌疫苗弱毒菌株特有抗原成分單抗，先分析強弱菌株各種抗原成分，找出抗原，然后通過親和層析法分離純化抗原用于免疫和篩檢。但是，研制不同型口蹄疫病毒12s抗原的群特異性單抗時，就不采取先分離群特異性抗原的技術路線，而是用一個型（A型）口蹄疫病毒12s抗原作免疫抗原，用另一個型（O型）口蹄疫病毒12s抗原作篩檢抗原，獲得成功。免疫抗原用鼠組織毒制備，不必精提，因為鼠源雜蛋白與Balb/c動物是同種，應屬弱抗原，顯然，后者的技術路線比前者的簡便得多。

（二）免疫

免疫的目的是為了獲得分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，并使B細胞在抗原刺激下分化，易于細胞融合，通常選用與骨髓瘤細胞系同系動物進行免疫。如用動物骨髓瘤細胞系，則選用2～3月齡的Balb/c動物；如用大鼠骨髓瘤細胞系則選用Lou/c大鼠。采用什么樣的免疫程序取決于具體抗原性狀和免疫對象以及要制備什么樣性質的單抗而定。但在多數情況下都是參照制備抗血清的常規(guī)免疫方法?；A免疫，如病毒抗原，多用福氏腹腔注射無佐劑抗原。一般認為，最后加強免疫采用靜脈途徑比腹腔好。具體方法：如制備口蹄疫病毒單抗，用福氏完全佐劑抗原，腹腔接種于Balb/c動物，每只20～30μg抗原，4～6周后用同樣劑量的無佐劑抗原靜脈注射，之后第三天取脾融合。用活毒免疫，方法簡便，易獲得IgM類中和單抗。如研制口蹄疫病毒單抗時所采用的活毒免疫法為：100LD₅₀的O型口蹄疫病毒活毒，用適當劑量（接種待免疫的同齡動物至致死率為10%左右），腹腔接種90日齡Balb/c動物，之后第7天融合，可獲得高滴度IgM類中和單抗。

此外，也有用其他動物的免疫脾細胞與動物骨髓瘤細胞融合，制備異源雜交瘤，生產非鼠源單抗。但這種雜交瘤不夠穩(wěn)定，染色體易丟失。在免疫方法上，還有把抗原直接注入脾內或取外周血淋巴細胞在體外培養(yǎng)中免疫。用這種免疫方法，3天后即可融合。對于來源困難、免疫原性差或對機體有害的抗原可用體外免疫。體外免疫的具體操作方法為：取脾細胞或外周血淋巴細胞制成單細胞懸液，用無血清培養(yǎng)液洗2～3次，然后懸浮于含10%小牛血清的全培養(yǎng)液中，加適量抗原（可溶性抗原一般為0.5～5.0μg/ml，細胞抗原為10⁵～10⁶個/ml），在37℃，5%～7% CO₂箱中培養(yǎng)3～5d，即融合。

（三）融合和選擇性培養(yǎng)

1.飼養(yǎng)細胞的制備　在HAT培養(yǎng)液中加入飼養(yǎng)細胞可促進融合后雜交瘤細胞的生長。動物腹腔巨噬細胞、正常脾細胞、胸腺細胞均可作為飼養(yǎng)細胞。由于腹腔巨噬細胞清除死亡的能力強，制備方便，故最為常用。具體操作是：在融合前1～2d，取Balb/c動物3～4只，拉頸致死，浸入75%酒精中消毒體表，然后用大頭針固定在蠟板上，在無菌條件下小心將腹部皮膚剪一小口（切勿剪破腹膜?。瑒冸x皮膚，暴露腹膜，用10ml注射器將5～7ml預冷的無血清培養(yǎng)液注入腹腔，不拔針頭，用彎頭鑷子夾住針眼處的腹膜，固定針頭，封住針口，用另一彎頭鑷子擠壓、揉動腹部約1min，然后吸出注入液體，加入冰浴冷卻的50ml尖底塑料離心管中，1000r/min，離心5～10min，棄上清，用10ml無血清基礎培養(yǎng)液重懸定容，計數細胞。根據需要留取適量細胞懸液，離心棄上清，用HAT培養(yǎng)液重懸，使細胞濃度為每毫升10⁵～2×10⁵個，加到96孔板中，每孔0.1ml，置37℃CO₂培養(yǎng)箱中待用。也可以在融合當天制備飼養(yǎng)細胞，加入HAT培養(yǎng)液中與融合細胞混合物一起分種于細胞板中?；罴毎嫈捣椒椋喝?.1ml細胞懸液，加0.9m10.4%臺盼藍染液混勻，用血球計數板計數。死細胞為藍色，活細胞不著色。鏡檢時，計數板四角大格內細胞數，壓線者只計上線和右線細胞。

2.骨髓瘤細胞的培養(yǎng)：維持動物骨髓瘤細胞于最佳生長狀態(tài)是融合成功的因素之一。這種細胞倍增時間一般為10～16h，在融合前一周內使其保持對數生長期。剛復蘇的細胞需2周時間才能達到適于融合狀態(tài)。融合時需收集2×10⁷個以上骨髓瘤細胞。具體操作為：將細胞培養(yǎng)瓶中液體吸出（或倒出），加入適量無血清基礎培養(yǎng)液，用彎頭吸管將細胞從瓶壁吹洗下來，用尖底塑料離心管收集細胞懸液，離心沉淀，棄上清，加入10ml無血清培養(yǎng)液重懸，進行活細胞計數?；罴毎麛祽?0%。

為防止在傳代過程中部分骨髓瘤細胞返祖，可用含15～20g/ml 8－氮鳥嘌呤的完全培養(yǎng)液定期處理骨髓瘤細胞，使其對HAT呈均一敏感性。

3.免疫脾細胞的制備　取加強免疫后3d的Balb/c動物1～2只，先眶下竇采血，供測抗體用，然后拉頸致死，浸入75%酒精中體表消毒，無菌剝離腹部皮膚，剪開腹膜，取脾，去脂肪和結締組織，放入約含5ml無血清培養(yǎng)液的平皿中的銅網上，用彎頭鑷子擠壓研磨，使細胞分散在液體中，棄渣，離心沉淀，棄上清，加入10ml無血清培養(yǎng)液重懸，按上述方法計數活細胞。

（四）細胞融合操作程序

1.融合

（1）按骨髓瘤細胞與脾細胞1∶5的比例取兩種細胞。一般取約2×10⁷個骨髓瘤細胞和10⁸個脾細胞加入50ml尖底塑料離心管中，混勻。

（2）以1000r/min離心10min，棄上清，倒置滅菌濾紙上吸幾次管口殘液，然后用手指彈擊管底，使沉淀細胞團成松散狀，置37℃水杯中預熱。

（3）用1ml吸管取0.7ml已在37℃溫箱中預熱的50% PEG（pH8.0）緩緩滴入含混合細胞的離心管中，邊滴邊搖動（離心管不離開水面），60s內滴完，然后在水中靜置90s。

（4）用20ml注射器取15ml預熱的無血清培養(yǎng)液，在2min內向融合管內滴完。開始時慢加，1min后加快，直至滴完。再補加15ml無血清培養(yǎng)液。

（5）以1000r/min，離心10min，棄上清，加入40ml含20%小牛血清HAT全培養(yǎng)液，輕輕吹吸幾次，分散細胞，用彎頭滴管分裝于含飼養(yǎng)細胞的4塊96孔板中，每孔0.1ml，蓋蓋，用膠紙（布）固定。

（6）將培養(yǎng)板置37℃，5%～7% CO₂溫箱中培養(yǎng)。

2.選擇性培養(yǎng)

（1）融合后用HAT全培養(yǎng)液培養(yǎng)7d后，用HT全培養(yǎng)液對培養(yǎng)板中液體進行半量換液。

（2）融合3d后開始鏡檢，觀察是否融合成功，不必天天鏡檢。

（3）融合后7d左右，逐孔鏡檢，標出每孔細胞群總數。

（4）當細胞群落已超過顯微鏡視野大時（培養(yǎng)10d左右），取上清液供抗體檢測，同時補加HT培養(yǎng)液。去掉A液后，細胞將恢復葉酸代謝途徑。

（五）雜交瘤細胞的篩選

融合后10d左右，如前所述采集待檢樣品，進行雜交瘤細胞的篩選。由于在一天內要報告幾百個樣品的檢測結果，且細胞上清液中抗體含量低微、過度生長的細胞轉移時成活率低，所以應采用快速、敏感、準確、穩(wěn)定的篩檢方法。以下簡單介紹抗體檢測技術的操作程序。

1.酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）　該法在雜交瘤細胞的篩選和單抗的鑒定中最為常用。根據反應方式不同，可將其分為以下四類。

（1）羊抗鼠或兔抗鼠雙抗體夾心ELISA：能識別所有鼠源抗體。凡是分泌鼠源抗體的雜交瘤細胞均可被篩選出來，然后再通過間接ELISA或捕獲ELISA或其他特異性檢測方法確定目的雜交瘤細胞。如果通過一次融合企圖獲取不同特異性的兩種或兩種以上的單抗，或在篩檢抗原制備困難而數量有了的情況下研制單抗時，均可采用此法先作初篩，縮小范圍，待進一步特異性篩檢。

（2）間接ELISA和捕獲ELISA：能識別與抗原相對應的特異性抗體。一般用于分泌特異性抗體的雜交瘤細胞的篩選和單抗特異性鑒定。其中捕獲ELISA，由于首先用多抗致敏酶標反應板、增強板對抗原的結合能力，因此一般來說它比間接ELISA更穩(wěn)定和敏感。

（3）液相ELSA：由于抗原和抗體在液相中反應，可以保持自然構型，所有表位處于完好狀態(tài)，并可與抗體進行全方位反應，其結果與中和反應較為一致，適于中和性單抗的篩選和病毒抗原表位分析。

在進行ELISA試驗時，每塊酶標板應設陰性和陽性對照。陰性對照可用骨髓瘤細胞上清或其腹水，或用其他單抗上清液或腹水；陽性對照用已建立的雜交瘤細胞上清或其腹水，或免疫動物多抗血清。結果常以P/N≥2.1，或P≥N＋3SD公式判定陽性。P代表陽性孔OD值，N代表一組陰性對照孔OD值的平均值，SD代表陰性對照標準差。因細胞上清樣品單抗含量低微，檢測時不作稀釋。

2.免疫酶組化法　主要用于檢測針對細胞抗原成分或細胞上病毒抗原成分的單抗。常用間接免疫過氧化物酶試驗（IIP）或堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶橋聯(lián)標技術（APAAP），鏡檢判定結果。

3.免疫熒光技術　與免疫組化法相似，主要用于各種細胞抗原成分和感染細胞中病毒抗原成分的檢測，具有操作簡便、敏感，可對抗原成分直觀定位等優(yōu)點，常用于單抗的篩選和鑒定。凡檢測針對細胞內成分的單抗，將細胞片經－20℃冷丙酮固定后作熒光染色；而檢測針對細胞內成分的單抗，則用活細胞作膜熒光染色。

4.放射免疫測定　在篩選和鑒定單抗時常用固相抗原法，其反應原理與ELISA相似，所不同的是用放射性同位素（如125 I）標記的羊或兔抗鼠抗體代替酶標抗體作指示系統(tǒng)。由于同位素半衰期的限制，操作規(guī)程同位素污染對人的危害以及廢物處理的困難，一般實驗室很少采用。

5.間接血凝試驗（IHA）　該法快速、簡便、較為敏感、影響因素少，易掌握，也常應用于單抗的篩檢。但因敏感性和反應范圍的限制，不如ELISA應用廣。

（六）雜交瘤細胞的克隆化

融合后必須對陽性孔中雜交瘤細胞進行克隆化，其原因是：融合后陽性孔中的雜交瘤細胞不一定都是目的細胞；一些雜交瘤細胞是不穩(wěn)定的，可能丟失染色體，喪失產生抗體能力，需不斷清除變異細胞；在液氮中長期保存的雜交瘤細胞也有喪失分泌抗體的可能。所有這些情況說明，需對雜交瘤細胞進行連續(xù)克隆化，以純化目的細胞。

最常用的克隆化方法是有限稀釋法，操作步驟如下。

1.提前1～2d向96孔板加動物腹腔巨噬細胞，置CO₂培養(yǎng)箱中備用，方法見細胞融合操作程序。

2.待克隆化的陽性融合細胞，可先轉入24孔板擴大培養(yǎng)后再克隆，也可邊擴大邊從96孔板取樣直接克隆。用吸管將細胞群吹打分散，制成懸液，按前述方法精確計數活細胞數。從96孔板直接取樣克隆，計數取樣只用1滴懸液，用另一支滴管加無血清培養(yǎng)液9滴作10倍稀釋，計數。用HT培養(yǎng)液將細胞稀釋至每毫升5、30或50個細胞各40ml；

3.每種雜交瘤細胞用一塊備用的含飼養(yǎng)細胞的96孔板，每個稀釋度32孔，每孔加細胞懸液0.1ml，每孔應含0.5、3和5個細胞。由于計數和加樣的誤差，往往偏高或偏低。如從96孔板直接取細胞克隆時，應在克隆完后立即把孔中和稀釋管中剩余細胞全部轉入24孔中擴大培養(yǎng)，以備失敗時重新克隆。

4.在37℃5%～7%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d左右，鏡檢，標出所有板孔的細胞群落數。按融合所述方法采樣，進行抗體檢測。

5.將單克隆陽性的細胞先轉入24孔，后在培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，然后凍存。

6.對于新融合的雜交瘤細胞，一般至少克隆2～3次。對于凍存的克隆細胞株，在復蘇時，最好同時克隆化，以不斷清除變異細胞，保持分泌抗體的穩(wěn)定性。

（七）細胞的凍存和復蘇

1.凍存液　20%小牛血清，10%二甲基亞砜（DMSO），70%基礎培養(yǎng)液，混勻，冰浴或冰冷。

2.凍存方法與步驟　收集處于對數生長期的細胞，離心沉淀，按5×10⁶～5×10⁷個/ml的最終細胞濃度，重懸于凍存液中，按每瓶1ml，分裝于2ml安瓿中，火焰封口，標上細胞名稱、凍存日期，裝入布袋中。將細胞置于泡沫塑料容器內，放入－70℃超低溫冰箱內，次日取出，立即投入液氮罐保存?；驅⒓毎?℃放置1h，然后移入液氮罐口，每5min下降2cm，在液氮面上停留30min以上，再浸入液氮中。

3.復蘇方法與步驟　從液氮中取出細胞安瓿，放人37℃水浴中，輕輕搖動，當只剩一點冰塊時，即取出置冰浴上。打開安瓿，將細胞移入含10ml無血清基礎培養(yǎng)液的尖底離心管中，輕輕搖動，離心沉淀，棄上清，用3～4ml全培養(yǎng)液或HT培養(yǎng)液重懸，移入5ml細胞培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%～7% CO₂溫箱中培養(yǎng)。如鏡檢時死細胞較多，可向培養(yǎng)液中加入最終濃度為10⁴～10⁵個/ml動物腹腔巨噬細胞。

（八）單克隆抗體的生產

單抗分體內生產法和細胞培養(yǎng)生產法，在一般實驗室條件下，體內生產法最為常用。

1.動物體內生產法　將0.5ml液體石蠟或降植烷注入Balb／c動物腹腔；7d后每只動物腹腔接種0.2ml計5×10⁵個細胞；5d后每天觀察動物腹部，當用手觸摸時皮膚有緊張感時，即用16～18號針頭采集腹水，如采2～3次，每只可采5～10ml腹水，抗體含量為每毫升1～5mg左右；離心管去細胞和其他沉淀物，收集上清，測定效價，分裝，－70℃存放。純化前，膜濾或高速離心再次除渣。

2.細胞生產法　一般實驗室制備單抗常用單層培養(yǎng)法。當細胞密度為1×10⁶～2×10⁶個／ml時，上清中的單抗體濃度為10～50μg/ml，所以大量生產單抗必須提高細胞密度。目前用于大量生產的是懸浮培養(yǎng)和細胞固定化培養(yǎng)兩大類，請參閱有關文獻。

（九）雜交瘤技術操作中應注意的主要問題

1.對所用的骨髓瘤細胞的使用歷史要清楚，一定是沒有污染的曾獲得高融合率的可靠細胞。融合時，骨髓瘤細胞要處于最佳生長狀態(tài)。

2.用于融合的主要試劑，如聚乙二醇（PEG）、胸腺嘧核苷（T）、次黃嘌呤和小牛血清的質量要可靠，特別是小牛血清和PEG，就是同一廠家不同批次產品的質量差異也影響融合的培養(yǎng)效果。在實驗室中一定要貯備經過融合考驗的主要試劑。對每批小牛血清都要作細胞生長試驗。

3.配液用的水質好壞也是一個重要問題。一般來說，無離子水再經雙蒸或三蒸用于配制各種液體是沒有什么問題。

4.在進行雜交瘤試驗之前，要調好培養(yǎng)箱溫度、CO₂濃度，使其穩(wěn)定，并保持飽和濕度。

5.嚴格無菌操作對搞好雜交瘤技術是至關重要的。一切用于培養(yǎng)的液體均需十分可靠。各種培養(yǎng)液的包裝盡量要小。同一包裝的液體最好一次用完，不能多次重復使用。每次使用的剩余液體要放在37℃溫箱菌檢。

大多數雜交瘤實驗室的問題的發(fā)生在污染和血清質量兩個方面。只要這兩個方面多加注意，一般都較順利。

（十）單抗的鑒定

在雜交瘤細胞建株時，要對每種單抗的特異性、同質性和理化性質等進行鑒定，以便應用。

1.特異性　單抗具有抗原表位特異性。在免疫動物過程中，抗原在機體有多少個表位暴露出來，就應產生多少種單抗。一個復雜抗原往往有株、亞型、型和屬特異性表位，有的還存在屬間交叉表位。相應地，單抗也應有上述特異性之別。病毒表位有中和和非中和之分，相應地，單抗也有中和及非中和單抗。不同抗原表位屬于不同抗原成分之上，決定免疫學反應性質。如針對新城疫病毒HN糖蛋白N端抗原表位的單抗具有較強的血凝抑制反應能力，而針對核衣殼蛋白抗原表位的單抗就沒有血凝抑制能力。鑒定單抗特異性，應根據不同目的，采取不同方法。欲鑒定單抗是株間、型間和屬間特異性，需收集不同型和同一型的不同毒（菌）株以及類屬病毒（菌），通過血清學方法（如ELISA），觀察與之反應的程度，確定特異性范圍。一般通過中和反應鑒定單抗是否具有中和反應能力。要明確單抗的靶抗原是哪種成分，往往通過免疫印跡法或放射免疫沉淀法。

2.同質性　單抗的同質性（即單克隆性）主要指免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型單一性、電泳均一性和雜交瘤細胞染色體數目等性質。

（1）重鏈和輕鏈類型：鑒定單抗重鏈和輕鏈類和亞類不僅可闡明單抗的同質性，而且確定單抗重鏈的類和亞類也有助于提純方法的選擇和了解其參與不同的免疫學性質的能力。單抗最常見的是IgG和IgM類，IgG又分為G_l、G_2a、G_2b和G₃四種亞類。鑒定單抗類和亞類時，通常采用瓊脂擴散法。先將雜交瘤細胞上清單抗?jié)饪s20～30倍，與抗動物類和亞類血清反應，觀察沉淀線。也可不濃縮上清液，用抗動物類和亞類抗體的酶結合物，通過ELISA鑒定。鑒定動物輕鏈是λ鏈還是k鏈的方法與上述鑒定重鏈的方法相同，也是通過免疫擴散試驗或ELISA來確定。

（2）電泳均一性：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、SDS－PAGE、等電聚焦電泳及免疫電泳等均可鑒定單抗的均一性。

3.理化特性　明確單抗在溫度、pH值變化的穩(wěn)定性和與抗原的親和力對應用十分重要。一般來說，純化的單抗，在56℃加熱5min，即失去活性。而未純化的腹水和血清單抗以及純化的多抗，56℃滅活后，活性沒有明顯變化。單抗經反復凍融，明顯喪失活性。加等量甘油，置30℃，因不凍結，保存一年以上活性不變。純化的單抗在pH6.0～8.0下穩(wěn)定，pH9.0～10.0活性明顯降低。但多抗活性在pH6.0～10.0不變。

不同單抗親和力不盡相同。一般通過競爭ELSA測定親和常數，以比較不同單抗相對親和力的大小。其操作步驟如下。

（1）取適宜濃度的純化抗原包被酶標板，100μl/孔，4℃過夜。

（2）洗滌后加封閉液（0.5% BSA－PBS，pH7.2），100μl/孔，37℃，1h。

（3）取一定濃度的純化待檢單抗與系列倍比稀釋抗原混合，4℃過夜，使反應達到平衡（抗原濃度要過量）。

4.洗滌后將平衡后的抗原－抗體混合物加入酶板孔中，100μl/孔，37℃，1h。

5.洗滌后，加HRP標記的抗動物第二抗體，100μl/孔，37℃，1h。

6.洗滌后加底物（OPD）溶液，100μl/孔，37顯色15min，2mol/L H₂SO₄終止反應，于495nm波長測定各孔吸收率（A）。