第四節(jié)　核酸電泳技術(shù)

帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運動稱為電泳。核酸電泳是進(jìn)行核酸研究的重要手段，是核酸探針、核酸擴(kuò)增和序列分析技術(shù)等所不可或缺的組成部分。核酸電泳通常在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行，濃度不同的瓊脂糖和聚丙烯酰胺可形成分子篩網(wǎng)孔大小不同的凝膠，可用于分離不同分子量的核酸片段。

凝膠電泳操作簡便、快速，可以分辨用其他方法（如密度梯度離心）所無法分離的核本片段，是分離、鑒定和純化核酸的一種常用方法。

一、瓊脂糖凝膠電泳

（一）原理

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物。將瓊脂糖在所需緩沖液中加熱熔化成清澈、透明的溶膠，然后倒入膠模中，凝固后將形成一種固體基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。將凝膠置電場中，在中性pH下帶電荷的核酸通過凝膠網(wǎng)孔向陽極遷移，遷移速率受到核酸的分子大小、構(gòu)象、瓊脂糖濃度、所加電壓、電場、電泳緩沖液、嵌入染料的量等因素影響。在不同條件下電泳適當(dāng)時間后，大小、構(gòu)象不同的核酸片段將處在凝膠不同位置上，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠的分離范圍較廣，用各種濃度的瓊脂糖凝膠可分離長度為200bp至50kb的DNA。

（二）儀器及試劑

儀器設(shè)備應(yīng)包括水平凝膠電泳槽及其配套電泳梳、穩(wěn)壓電泳儀、微波爐或普通電爐。同時配備紫外線檢測儀和照相系統(tǒng)。

試劑包括瓊脂糖、電泳緩沖液、溴化乙錠溶液、凝膠加樣緩沖液。

電泳緩沖液常用TBE（1000ml中含5.4gTris，2.75g硼酸，2ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）

溴化乙錠（ethidium bromide，EB）是一種熒光染料，它可以嵌入核酸鏈的配對堿基之間，在電泳過程中隨核酸片段遷移，將凝膠置紫外光下，插入核酸鏈中的EB在紫外線激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，可清楚顯示各核酸片段的遷移。EB見光易分解，應(yīng)存棕色試劑瓶中于4℃下保存。由于EB是一種強(qiáng)的誘變劑并有中度毒性，使用時必須戴手套操作。

（三）凝膠的制備和電泳操作方法

1.用透明膠將玻璃板或電泳裝置所配備的膠板的邊緣圈封，制成膠模，置水平工作臺上。

2.稱取適量瓊脂糖，置電泳緩沖液中，加熱使瓊脂糖溶解。

3.待溶液冷至60℃，加入10mg/ml EB貯存液使終濃度達(dá)0.5mg/ml。

4.在距離膠模底板0.5～1mm處放置電泳梳，將瓊脂糖溶液倒入膠模中，厚度為3～5mm，注意避免產(chǎn)生氣泡。

5.凝膠完全凝固后，移去梳子和透明膠，將凝膠放入電泳槽。加入TBE緩沖液使恰好過膠面約1mm。

6.將DNA樣品與1/6體積加樣緩沖液混合后，加入樣品槽中。

7.接通電源，使樣品槽在負(fù)極端，用1～5V/cm的電壓，電泳適當(dāng)時間。

8.電泳結(jié)束后，可將含EB的凝膠直接放在紫外線檢測儀上觀察，并拍照記錄，也可將不含EB的凝膠在0.5μg/ml的EB溶液中染色30～45min，再如上觀察和拍照，記錄結(jié)果。

（四）凝膠攝影

需配置135照相機(jī)，全色135膠卷，照相機(jī)固定架，近攝鏡和紅色濾光鏡以及有機(jī)玻璃防護(hù)面罩。操作需在暗室進(jìn)行，將相機(jī)固定好，把凝膠放在紫外檢測儀上適當(dāng)位置，調(diào)焦，裝上紅色濾光片，按常規(guī)拍照。亦可使用凝膠自動處理系統(tǒng)，但儀器費用較高。

（五）注意事項

EB溶液的凈化處理　由于EB具有一定的毒性，實驗結(jié)束后，應(yīng)對含EB的溶液進(jìn)行凈化處理再行棄置，以避免污染環(huán)境和危害人體健康。

1.對于EB含量大于0.5μg/ml的溶液，可如下處理。

（1）將EB溶液用水稀釋至濃度低于0.5μg/ml。

（2）加入一倍體積的0.5mol/L KMnO₄，混勻，再加入等量的25mol／L HCl，混勻，置室溫數(shù)小時。

（3）加入一倍體積的25mol/L NaOH，混勻并廢棄。

2.EB含量小于0.5g/ml的溶液可如下處理。

（1）按lmg/ml的量加入活性炭，不時輕搖混勻，室溫放置1h。

（2）用濾紙過濾并將活性炭與濾紙密封后丟棄。

二、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）

（一）原理

聚丙烯酰胺凝膠通過丙烯酰胺單體、鏈聚合催化劑N，N，N＇，N＇－四甲基乙二（TEMED）和過硫酸銨以及交聯(lián)劑N，N＇－亞甲雙丙烯酰胺之間的化學(xué)反應(yīng)而形成。丙烯酰胺單體在催化劑作用下產(chǎn)生聚合反應(yīng)形成長鏈，長鏈經(jīng)交聯(lián)劑作用交叉連接形成凝膠，其孔徑由鏈長和交聯(lián)度決定。鏈長取決于丙烯酰胺的濃度，調(diào)節(jié)丙烯酰胺和交聯(lián)劑的濃度比例，可改變聚合物的交聯(lián)度。聚丙烯酰胺凝膠電泳根據(jù)電泳樣品的電荷、分子大小及形狀的差別達(dá)到分離目的，兼具分子篩和靜電效應(yīng)，分辨率高于瓊脂糖凝膠電泳?？煞蛛x只相差1個核苷酸的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分析和制備長度小于1kb的DNA片段。根據(jù)所要分離的核酸片段大小，可制備不同濃度的凝膠。

（二）凝膠的制備和電泳

由于氧能抑制丙烯酰胺的聚合反應(yīng)，灌制聚丙烯酰胺凝膠常在兩塊封閉的玻璃平板所形成的夾層間進(jìn)行。在這種裝置形式下，僅有頂層的凝膠與空氣中的氧氣相接觸，從而大大減少了氧對聚合的抑制作用。聚丙烯酰胺凝膠電泳一般采用垂直裝置。

1.材料與方法

（1）試劑配制

①30%丙烯酰胺：100ml雙蒸水中含29g丙烯酰胺和1g N，N’－亞甲雙丙烯酰胺。

②5×TBE：每升溶液含54g Tris.HCl，27.5g硼酸和20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。

③10%過硫酸銨:10ml雙蒸水中含1g過硫酸銨。

（二）凝膠的制備和電泳操作

①將玻璃和墊條事先用去污劑刷洗，并經(jīng)自來水和無離子水沖洗干凈，晾干。裝置時，將較大的玻璃板平放在工作臺上，將兩個墊條放在玻璃板兩側(cè)，涂上少量凡士林，并將上層玻璃板置于墊條上，用夾子將玻板連同墊條夾緊，底部用1%瓊脂糖密封。為防止漏膠，除放梳子一邊外，其余三邊用防水膠帶密封。

②根據(jù)玻璃板大小及夾層厚薄計算所需凝膠溶液量，計算配制溶液（100m1）。將35μl TEMED加入100ml混合液中，混勻，然后均勻連續(xù)注入兩玻璃板空隙中。

③立即插入電泳梳，勿使梳齒下形成氣泡。

④室溫聚合1h，梳齒下出現(xiàn)折光帶時，表明聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。若凝膠不立即使用，可用紗布或濾紙（用1×TBE浸泡）包蓋于凝膠頂部，置4℃保存1～2d。

⑤拔掉梳子，立即用水沖洗加樣孔。

⑥除去底部膠帶，將凝膠直立放入電泳槽。在上下兩槽中灌好1×TBE溶液，驅(qū)盡凝膠底部附著的氣泡。并用1×TBE溶液沖洗加樣孔。

⑦將核酸樣品與適量6×凝膠加樣緩沖液混合，并加入凝膠加樣孔中。

⑧接通電源，正極與下槽連接。電壓一般控制在1.8V/cm。電壓過高時凝膠產(chǎn)生的熱量可造成DNA區(qū)帶彎曲，甚至引起小DNA片段的解鏈。

⑨電泳畢，取下玻板和凝膠，放在工作臺上，從夾層一角輕撬，將上面的玻板輕輕移開，并小心揭下凝膠，置染色液中染色并進(jìn)行結(jié)果觀察。

（3）凝膠的染色和觀察：聚丙烯酰胺凝膠中核酸帶的染色，常用溴化乙錠法和銀染法。前者與瓊脂糖凝膠的染色方法相同。銀染法的靈敏度較高，可如下操作。

①將凝膠置固定液（10%乙醇、0.5%冰醋酸）中固定10min。

②雙蒸水洗1～2次；

③置0.01mol/L AgNO₃溶液中，室溫反應(yīng)15min～30min。

④充分水洗。

⑤置NaOH－甲醛混合液（200ml 3% NaOH，含1ml甲醛）中反應(yīng)至條帶顯色清晰，本底適宜。

⑥用5%冰醋酸終止反應(yīng)。