13．2．4　黃嘌呤氧化酶－NBT還原法

13．2．4．1　原理

原理與NBT還原法類似，所不同的是采用黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤底物作為的產(chǎn)生體系。后者再將NBT還原為顯色物質(zhì)，通過進行比色測定得知SOD對NBT還原的抑制，并根據(jù)抑制率計算樣品SOD活性。

13．2．4．2　儀器及試劑

（1）儀器：分光光度計。

（2）試劑：①0．2mol/L磷酸氫二鉀（甲液）：稱取K₂HPO₄·3H₂O 9．13g，雙蒸水溶解并定容至200mL。②0．2mol/L磷酸氫二鉀（乙液）：稱取K₂HPO₄1．36g，用雙蒸水50mL溶解。③0．2mol/L磷酸鉀緩沖液（pH為7．8）：取甲液183mL，加乙液17mL混合即成。④0．4mol/L EDTA－NaOH緩沖液（pH為7．8）：稱取乙二胺四乙酸（EDTA）1．49g，加雙蒸水2～3mL，再加1mol/L NaOH溶液5mL，水浴加熱溶解，最后定容至10mL。⑤10mmol/L黃嘌呤：溶于0．1mol/L NH₄OH溶液內(nèi)。⑥7．5mmol/L氯化硝基四唑氮藍（也稱氮藍四唑，NBT）：溶于20%乙醇。⑦混合底物緩沖液：各取上述③液135mL、④液0．188mL、⑤液4．5mL、⑥液3．75mL混合，最后加雙蒸水補足至240mL。⑧黃嘌呤氧化酶：用時以50mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH為7．8）配成0．04u/mL的溶液。⑨SOD標準液：用20%乙醇配制成1mg/mL的貯備液，用前稀釋為10μg/mL。

13．2．4．3　步驟

（1）按表13－4加樣（單位為mL）。

表13－4　黃嘌呤氧化酶－NBT還原法加樣表

（2）各管加樣后，置25℃恒溫水浴預溫5～10min，同時將黃嘌呤氧化酶溶液預溫。

（3）各管置25℃水浴中，每間隔30s依次向各管加入預溫的黃嘌呤氧化酶（0．04u/mL）0．3mL，各管于25℃水浴內(nèi)作用12min后取出。

（4）選定測定波長為560nm，以底物緩沖液校正零點，讀取各管吸光度值。

13．2．4．4　SOD酶活性計算

單位定義：在以上規(guī)定條件下，NBT還原被SOD抑制50%所需的酶量為1u。

上式中A₀——未受SOD抑制的吸光度；A_u——測定樣品的吸光度；A_s——SOD標準管的吸光度；10——SOD標準液的濃度10μg/mL；c_Pr——樣品液的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

13．2．4．5　注意事項

（1）若樣品對NBT還原的抑制范圍在35%～65%，基本上可按上式計算SOD酶活性，超過此范圍可適當濃縮或稀釋樣品液，再行測定。

（2）測定過程中加入黃嘌呤氧化酶12min后，反應達到平臺，在以后的30～60min內(nèi)吸光度值無明顯變化，故選取12min測定吸光度值。

（3）溫度對本法測定有影響。溫度越高，達到對NBT還原抑制50%所需的SOD量越多，反應速率加大，吸光度值增高；而溫度過低，則測定靈敏度下降。

（4）用20%乙醇配制的SOD標準液，于4℃可保存45天。

（5）待測樣品不可混濁。NBT反應還受組織中其他蛋白質(zhì)等雜質(zhì)影響，因此測定生物組織樣品中SOD含量，其結果會受到影響。NBT還易與有機自由基如RO·或ROO·反應。

（6）采用本法測定SOD活性的靈敏度較細胞色素c還原法高，將黃嘌呤濃度降低可再提高靈敏度。

（7）NBT還原機制復雜，中間物NBT自由基既可與NBT自由基結合成為甲暅，也可與O₂發(fā)生可逆反應生成，即NBT既可清除又可生成。因此SOD對NBT還原反應的作用有兩種可能性，一是與NBT競爭，使NBT的還原反應受到抑制，二是催化歧化，使NBT自由基與O₂的可逆反應平衡趨向于NBT再生。