16．4．1　化學(xué)部分

1）新藥名稱按衛(wèi)生部衛(wèi)藥政發(fā)（91）第63號(hào)《西藥（原料藥）命名原則》的要求將該新藥原料藥命名為“超氧化物歧化酶溶液”，其制劑命名為“注射用超氧化物歧化酶”。

2）國(guó)內(nèi)外專利及行政保護(hù)檢索。

經(jīng)檢索，該藥品在我國(guó)不受專利和行政保護(hù)。

3）結(jié)構(gòu)確證。

自制的精制超氧化物歧化酶樣品（純度為電泳純），與國(guó)外文獻(xiàn)對(duì)照進(jìn)行了下列試驗(yàn)。

（1）測(cè)試了理化常數(shù)：相對(duì)分子質(zhì)量為31　600，等電點(diǎn)（pI）為7．12。

（2）以原子吸收光譜法，對(duì)Cu^2＋和Zn^2＋進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明豬血－SOD每個(gè)分子含Cu^2＋和Zn^2＋各兩個(gè)。

（3）在pH為7．0的2．5mmol磷酸鹽緩沖液中，測(cè)定了UV－VIS，UV 250～270nm呈現(xiàn)鋸齒型峰域，UV－λ_max為265nm，摩爾吸收系數(shù)ε_M265nm為10　080，VIS－λ_max為680nm，摩爾吸收系數(shù)ε_M630nm為340。

4）工藝、處方研究情況。

（1）原料藥制備工藝。根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料，結(jié)合我國(guó)資源的實(shí)際情況，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)室研究，最終選定了以新鮮豬血為原料，經(jīng)除血漿、浮洗、溶血、除血紅蛋白、鹽析除雜蛋白和鹽析沉淀六個(gè)步驟得SOD粗品，再經(jīng)溶解、透析、兩次柱層析、透析四個(gè)步驟得精品液，SOD收得率為50%～60%。

（2）制劑處方優(yōu)選。參考國(guó)內(nèi)部分生化藥物凍干制劑的處方，設(shè)計(jì)了11個(gè)不同的處方，比較了不同的輔料和濃度對(duì)凍干制劑的成形以及穩(wěn)定性的影響。通過(guò)考察，以處方用一種輔料——乳糖，凍干品成形較好，穩(wěn)定性最好，成本也較低。本處方的特點(diǎn)是成品外觀均勻，有一定結(jié)構(gòu)強(qiáng)度，引濕性較低。

制劑的制備工藝是：先將乳糖配成20%的溶液，加入藥用活性炭除熱源，再將SOD溶液加入少量活性炭除熱源，最后將兩者按處方的規(guī)定混勻并補(bǔ)充注射用水至所需量，經(jīng)除菌過(guò)濾、分裝、凍干、熔封即得。

5）理化常數(shù)、純度檢查、含量測(cè)定等質(zhì)量研究工作。

（1）物理常數(shù)：研究了8個(gè)物理常數(shù)，即相對(duì)分子質(zhì)量為31　600，UV 250～270nm呈鋸齒型吸收峰域，UV－λ_max為265nm，ε_M265nm為10　080，VIS－λ_max為680nm、ε_M630nm為340、等電點(diǎn)為7．12、每個(gè)分子含Cu^2＋和Zn^2＋各兩個(gè)，與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道一致。

（2）鑒別試驗(yàn)：作了兩項(xiàng)鑒別試驗(yàn)，一是在pH為8．2的緩沖液中用本品抑制連苯三酚的自氧化，該反應(yīng)為自由基清除劑專有的反應(yīng)；二是紫外吸收特性即A（265±3）nm/A_280nm之值不小于1，因本品在265nm處的吸光度大于A_280nm。這兩項(xiàng)鑒別指標(biāo)相結(jié)合，對(duì)本品的鑒別是專一的。

（3）純度檢查：在鑒別試驗(yàn)中A_{（265±3）nm}/A_280nm之值實(shí)際上也是純度檢查的項(xiàng)目之一，用于檢查是否含有過(guò)多的雜蛋白。另外，根據(jù)生產(chǎn)工藝可能引進(jìn)的雜質(zhì)和生化藥品的特點(diǎn)，作了pH值、硫酸鹽和熱源三項(xiàng)檢查，檢查方法按中國(guó)藥典1990年版有關(guān)規(guī)定，均合格。

（4）效價(jià)、含量測(cè)定：效價(jià)測(cè)定比較了國(guó)外報(bào)道的SOD測(cè)定的四種方法，確定了連苯三酚自氧化法。該方法不僅有一定專屬性，而且有靈敏度高（1～10μg即可檢出）、穩(wěn)定、重現(xiàn)性較好等特點(diǎn)。蛋白含量測(cè)定采用定氮法，定氮采用中國(guó)藥典1990年版附錄63頁(yè)規(guī)定的方法，所得氮含量乘以6．25即為蛋白含量。該法重現(xiàn)性好。

6）穩(wěn)定性研究情況。

（1）原料藥“超氧化物歧化酶溶液”。

①影響因素試驗(yàn)：取3批樣品，分別灌封于2mL安瓿中，熔封作試驗(yàn)樣品。將樣品露置于下述條件，于不同時(shí)間取樣考察與0d考察數(shù)據(jù)比較。

在5℃、25℃、40℃、60℃和80℃分別進(jìn)行了10d的試驗(yàn)，結(jié)果表明：在5℃條件下，外觀、pH值、效價(jià)基本沒(méi)有改變；25℃放置10dpH值約降低0．2個(gè)單位，效價(jià)損失約10%；40℃放置，pH值也明顯降低，10d效價(jià)幾乎為0；在60℃和80℃放置1d，效價(jià)幾乎為0。各溫度下放置的樣品，電泳法檢查未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物。

2　000～3　000Lx光照10d，試驗(yàn)結(jié)果表明，3批樣品的pH值和效價(jià)均明顯降低，效價(jià)損失約20%，電泳檢查未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物。

高濕度試驗(yàn)因原料藥為水溶液，未進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn)。

空氣暴露10d試驗(yàn)。將樣品液放入小燒杯內(nèi)于室溫放置，溫度為18℃～23℃放置10d，結(jié)果表明：原料藥“超氧化物歧化酶溶液”放置1d即開始出現(xiàn)乳光，放置3d開始渾濁，顏色也由藍(lán)綠色變?yōu)辄S綠色，效價(jià)急劇下降，于10d效價(jià)損失約90%。

②加速試驗(yàn)：將上市包裝樣品置40℃、相對(duì)濕度75%條件下放置3個(gè)月，結(jié)果表明：pH值略有升高、效價(jià)略有降低，但無(wú)降解產(chǎn)物。

③室溫留樣考察：3批樣品在上市包裝情況下室溫放置36個(gè)月，期間定期觀察。結(jié)果表明：注射用超氧化物歧化酶經(jīng)36個(gè)月的放置，活性下降在10%以內(nèi)，與動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證明注射用超氧化物歧化酶對(duì)高溫、光照不穩(wěn)定，打開安瓿后有強(qiáng)的吸濕性且不穩(wěn)定，但在室溫條件下很穩(wěn)定，留樣考察和動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)均證明效價(jià)降低10%的效期為3年以上。因此，可將本品在涼暗處遮光熔封保存的有效期定為2年。

（2）制劑“注射用超氧化物歧化酶”

①影響因素試驗(yàn)。取3批樣品，除去外包裝，直接露置于下述條件下，于不同時(shí)間取樣考察與0d考察數(shù)據(jù)比較。

（A）在30℃、40℃和80℃分別進(jìn)行了10d的試驗(yàn)，結(jié)果表明：在30℃條件下，外觀、pH值、效價(jià)基本沒(méi)有改變；40℃pH值略有升高，效價(jià)略有下降，但影響很??；在80℃，pH值和效價(jià)急劇下降，于第3d變?yōu)榈S色，于第5d變?yōu)樽攸S色，效價(jià)也降為0。40℃放置10d的HPLC圖譜與0d比較無(wú)任何改變，80℃放置3d，HPLC圖譜即有很大變化。

（B）2000～3000Lx光照10d，試驗(yàn)結(jié)果表明：3批樣品的pH值有升高，效價(jià)降低約10%，HPLC檢查未發(fā)現(xiàn)降解產(chǎn)物。

（C）在相對(duì)溫度75%和92．5%分別放置10d，結(jié)果表明：打開安瓿的注射用超氧化物歧化酶有強(qiáng)的吸濕性，吸溫后pH值降低、效價(jià)下降、無(wú)菌檢查也不合格，但HPLC檢查無(wú)降解產(chǎn)物。

（D）將安瓿打開后空氣暴露10d，結(jié)果表明：制劑吸濕、pH值降低、活性下降、無(wú)菌檢查也不合格，但吸濕后HPLC檢查無(wú)降解產(chǎn)物。

②加速試驗(yàn)。將上市包裝樣品置40℃、相對(duì)濕度為75%的條件下放置3個(gè)月，結(jié)果表明：pH值略有升高、效價(jià)略有降低，但無(wú)降解產(chǎn)物。

③室溫留樣考察。3批樣品在上市包裝情況下室溫放置36個(gè)月，其間定期考察，結(jié)果表明：注射用超氧化物歧化酶經(jīng)36個(gè)月的放置，活性下降在10%以內(nèi)，與動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果一致。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，證明注射用超氧化物歧化酶對(duì)高溫、光照不穩(wěn)定，打開安瓿后有強(qiáng)的吸濕性且不穩(wěn)定，但在室溫條件下很穩(wěn)定，留樣考察和動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)均證明效價(jià)降低10%的有效期為3年以上，因此，可將本品在涼暗處遮光熔封保存的有效期定為2年。

7）藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

根據(jù)原料藥和制劑的4號(hào)資料研究結(jié)果，制訂質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)情況如下。

（1）超氧化物歧化酶溶液。

本原料標(biāo)準(zhǔn)的制訂參照了中國(guó)藥典1990年版326頁(yè)細(xì)胞色素c的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定如下。

含量限度：每1mL不低于80　000u，比活不小于4　000u/mg蛋白。

性狀：藍(lán)綠色溶液。

鑒別：抑制連苯三酚自氧化的呈色反應(yīng)和紫外吸收特性（A_{（265±3）nm}/A_280nm不小于1）。

檢查：酸堿度（pH值6．0～8．0）、硫酸鹽、熱原。

含量測(cè)定：采用連苯三酚自氧化法測(cè)效價(jià)，定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量。

類別：超氧自由基清除劑。

貯藏：密封，遮光，－10℃保存。

（2）注射用超氧化物歧化酶。

本制劑標(biāo)準(zhǔn)的制訂參照了中國(guó)藥典1990年版328頁(yè)注射用細(xì)胞色素c的標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定如下。

含量限度：效價(jià)不得低于標(biāo)示量的85%～120%。

性狀：微藍(lán)綠色或類白色塊狀物或粉末。

鑒別：同超氧化物歧化酶溶液。

檢查：酸堿度（pH值6．0～8．0）、無(wú)菌、熱原、過(guò)敏實(shí)驗(yàn)。

效價(jià)測(cè)定：同超氧化物歧化酶溶液。

類別：同超氧化物歧化酶溶液。

劑量：肌內(nèi)、皮下或炎癥局部注射，一次40　000u，每日1次；或一次80　000u，隔日一次。

規(guī)格：20　000u/支，40　000u/支。

貯藏：熔封，在涼暗處保存。