第五節(jié)　發(fā)酵工程和蛋白質(zhì)工程

一、發(fā)酵工程

發(fā)酵工程是生物工程的主要基礎(chǔ)和支柱。17世紀(jì)時荷蘭人列文虎克發(fā)明了顯微鏡，用顯微鏡發(fā)現(xiàn)了微生物，也看到了釀酒的酵母中有微生物，即酵母菌。但是，酵母菌究竟是發(fā)酵的“因”還是發(fā)酵的“果”，直到19世紀(jì)才由法國化學(xué)家、微生物家巴斯德搞清楚。他通過確鑿的實驗證明，沒有活的酵母菌就不能引起發(fā)酵，酒變質(zhì)則是由于有其他微生物在起作用。至此，人們才知道了微生物在發(fā)酵過程的作用，也有了防止酒變質(zhì)的方法——巴斯德滅菌法。巴斯德本來定義發(fā)酵為微生物在缺氧條件下的生理過程，在這種條件下不能把糖類物質(zhì)徹底氧化為二氧化碳和水，而是生成了酒精和乳酸等物質(zhì)?，F(xiàn)在發(fā)酵這一術(shù)語則泛指一切利用微生物生產(chǎn)產(chǎn)品的過程，包括厭氧發(fā)酵和好氧發(fā)酵。

發(fā)酵工程技術(shù)可以分為上游技術(shù)、中游技術(shù)和下游技術(shù)三個階段。上游技術(shù)主要是指菌種的選育。優(yōu)良菌種的選育不僅為發(fā)酵工業(yè)提供了高產(chǎn)生產(chǎn)菌株，還可以提供各種類型的突變株，改善其生理生化特性，去除多余的代謝途徑和產(chǎn)物，有利于合成新的產(chǎn)物，改善發(fā)酵工藝條件，提高產(chǎn)品質(zhì)量，增加經(jīng)濟(jì)效益。

菌種選育不僅需要微生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)、生物化學(xué)和分子遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)，而且也是應(yīng)用性很強(qiáng)的實用技術(shù)。在優(yōu)良菌種選育過程中要全面地、辯證地分析問題，靈活而又巧妙地將理論與技術(shù)結(jié)合，應(yīng)用于菌種選育的實踐中。目前在菌種選育中主要還是采用自然選育和誘變育種的方法，工作量大，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典的遺傳育種范疇。近20年來，由于分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞融合、代謝工程等技術(shù)作為具有定向作用的育種方法，獲得一定成功，受到人們的高度重視，并以極大的熱情探索這些新技術(shù)在育種上的應(yīng)用。

中游技術(shù)是指微生物的發(fā)酵生產(chǎn)，其本質(zhì)是具有相同特性的微生物在控制條件下的培養(yǎng)。微生物發(fā)酵的方法很多，大致可歸為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩大類，液體發(fā)酵是當(dāng)今發(fā)酵工業(yè)的主體。固體發(fā)酵是利用固體培養(yǎng)基進(jìn)行微生物生產(chǎn)，它是一種傳統(tǒng)的微生物生產(chǎn)方法，如醬油的釀造，食用菌生產(chǎn)中玻璃瓶裝固體發(fā)酵等。固體發(fā)酵最常用的原料是農(nóng)副產(chǎn)品，如麩皮、米糠、豆餅、山芋粉。對于好氧菌可采用油層固體培養(yǎng)法，使用曲盤等一些簡單設(shè)備，在曲室里保溫、保濕培養(yǎng)，以獲得大量的固體曲。所謂“曲”是指發(fā)酵后的基質(zhì)、微生物及其代謝產(chǎn)物混雜在一起的總稱，如酒曲、糖化曲。對于厭氧菌可使用大缸、水泥池等，造成一個厭氧環(huán)境，任其發(fā)酵。固體發(fā)酵的優(yōu)點是設(shè)備簡單，投資少，適合小規(guī)模生產(chǎn);缺點是占地大，勞動強(qiáng)度高，產(chǎn)品質(zhì)量不太穩(wěn)定。隨著它的推廣普及，又有不少創(chuàng)新和改進(jìn)，如目前醬油釀造、乙醇發(fā)酵等大工業(yè)生產(chǎn)多采用通風(fēng)發(fā)酵池生產(chǎn)法。

下游技術(shù)也稱為下游加工過程，是生物化學(xué)工程的組成部分。可分為4個階段:(1)培養(yǎng)液的預(yù)處理和固液分離。(2)初步純化。(3)高度純化。(4)成品加工。

二、蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程是研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，然后人為地設(shè)計一個新蛋白質(zhì)，并按這個設(shè)計的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去改變其基因結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì);或者從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系出發(fā)，定向地改造天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是對功能基因的修飾，也可以制造新型的蛋白質(zhì)。1983年，美國科學(xué)家烏爾莫(Ulmer)在《Science》上發(fā)表以“Protein Engineering”(蛋白質(zhì)工程)為題的專論，一般將此視為蛋白質(zhì)工程誕生的標(biāo)志。蛋白質(zhì)工程的實踐依據(jù)DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)，因此，人們可以根據(jù)需要對負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行重新設(shè)計，使合成出來的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得符合人們的要求。由于蛋白質(zhì)工程是在基因工程的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在技術(shù)方面有諸多同基因工程技術(shù)相似的地方，因此蛋白質(zhì)工程也被稱為第二代基因工程。

蛋白質(zhì)工程第一個十分成功的范例是胰島素的人工合成。1965年，中國科學(xué)院和北京大學(xué)生物系聯(lián)手首次人工合成了牛胰島素，成了轟動世界的大事。1953年，英國生物化學(xué)家桑格(Frederick Sanger)破譯出由17種51個氨基酸組成的兩條多肽鏈牛胰島素的全部結(jié)構(gòu)。這也是人類第一次搞清一種重要蛋白質(zhì)分子的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，從1958年開始，中國科學(xué)院上海生化研究所、上海有機(jī)化學(xué)研究所和北大生物系三個單位聯(lián)合成立一個協(xié)作組，開始探索用化學(xué)方法合成胰島素。1965年9月7日，協(xié)作組完成了結(jié)晶牛胰島素的全合成，經(jīng)過嚴(yán)格鑒定，這種人工合成的結(jié)晶牛胰島素在結(jié)構(gòu)、生物活力、物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)晶形狀上都與天然的牛胰島素完全一樣。人工合成結(jié)晶牛胰島素是世界上第一個人工合成的蛋白質(zhì)，為人類認(rèn)識生命、揭開生命奧秘邁進(jìn)了一大步。

當(dāng)前，蛋白質(zhì)工程是發(fā)展較好、較快的生物技術(shù)。這是因為在進(jìn)行蛋白質(zhì)分子設(shè)計后，已可應(yīng)用高效的基因工程來進(jìn)行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特等在1982～1985年間對酪氨酰－tRNA合成酶的分子改造工作。他根據(jù)X射線衍射實測該酶與底物結(jié)合部位結(jié)構(gòu)，用定位突變技術(shù)改變與底物結(jié)合的氨基酸殘基，并用動力學(xué)方法測量所得變體酶的活性，深入探討了酶與底物的作用機(jī)制。1987年福什特通過用Lys代替枯草桿菌蛋白酶分子表面的Asp(99)和Glu(156)，而導(dǎo)致了活性中心His(64)質(zhì)子pKa從7下降到6，使酶在pH= 6時的活力提高10倍，從而帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益。蛋白工程還可對酶的催化活性、底物專一性、抗氧化性、熱變性、堿變性等加以改變。由此可以看出蛋白工程的威力及其光輝前景。上述各例是通過對關(guān)鍵氨基酸殘基的置換與增刪進(jìn)行蛋白工程的一類方法。另一類是以某個典型的折疊進(jìn)行“從頭設(shè)計”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功設(shè)計并合成了由四段反平行α－螺旋組成為73個氨基殘基的成果。這顯示，按人們預(yù)期要求，通過從頭設(shè)計以折疊成新蛋白的目標(biāo)已基本成為可能。

蛋白質(zhì)工程匯集了當(dāng)代分子生物學(xué)等學(xué)科的一些前沿領(lǐng)域的最新成就，它把核酸與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與生物功能結(jié)合起來研究。蛋白質(zhì)工程將蛋白質(zhì)與酶的研究推進(jìn)到嶄新的時代，為蛋白質(zhì)和酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥方面的應(yīng)用開拓了誘人的前景。蛋白質(zhì)工程開創(chuàng)了按照人類意愿改造、創(chuàng)造符合人類需要的蛋白質(zhì)的新時期。