實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目五　血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳

學(xué)習(xí)目標(biāo)

【知識目標(biāo)】

（1）能夠迅速而準(zhǔn)確地陳述血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳的操作要點(diǎn)。

（2）能用自己的語言描述血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳的原理。

【能力目標(biāo)】

（1）能夠準(zhǔn)確描述電泳法分離的血清脂蛋白成分。

（2）能夠通過血清脂蛋白電泳結(jié)果鑒別高脂蛋白血癥的分型。

（3）能夠鑒定血清脂蛋白電泳結(jié)果的異常狀態(tài)，并能說明其臨床意義。

（4）能夠熟練使用離心機(jī)、恒溫水浴箱。

案例引導(dǎo)

患者，男，50歲，在體格檢查時(shí)血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：α－脂蛋白含量正常，β－脂蛋白含量明顯增高，前β－脂蛋白含量增高，無乳糜微粒。請初步診斷其患有何種??？且屬于該病的哪種類型？

（提示：Ⅱb型高脂蛋白血癥）

【實(shí)驗(yàn)原理】

血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳采用的支持介質(zhì)是瓊脂糖。瓊脂糖是經(jīng)過挑選，以質(zhì)地較純的瓊脂作為原料，分離去除瓊脂膠成分而得到的一種多糖，由D－半乳糖和3，6脫水L－半乳糖的殘基交替排列組成，再加水制成具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。瓊脂糖主要通過氫鍵形成凝膠。電泳時(shí)，因?yàn)槟z中含水量大（98%～99%），近似自由電泳，固體支持物的影響較少，故電泳速度快、區(qū)帶整齊、分辨率高。同時(shí)，瓊脂糖因不含帶電荷的硫酸根和羧基，故幾乎無電滲作用，對蛋白質(zhì)吸附極微且?guī)缀鯚o拖尾，另外，還具有均一性好、牢固、富有彈性、透明、容易固定和干燥的特點(diǎn)，可制成清晰的膜，不吸收紫外線，便于掃描保存。瓊脂糖是一種良好的電泳材料，分離效果較好，適用于蛋白質(zhì)或核酸等大分子的分離、純化、檢測等，為臨床不同類型的高脂蛋白血癥、冠心病等檢測提供生化指標(biāo)，也常用于LDH、CK等同工酶的分離與檢測。

血清中脂類物質(zhì)均與載脂蛋白結(jié)合成水溶性的脂蛋白形式。各種脂蛋白中所含載脂蛋白的種類及數(shù)量不同，各種脂蛋白顆粒大小相差也很大。根據(jù)Stoke定律，假定帶電粒子為球形，帶電粒子在電場中的電泳速度可用下列公式表示：

血清脂蛋白在同一pH值溶液中，可解離成帶有不同電荷的離子，這些離子因電荷量、顆粒大小等差異，故在瓊脂糖凝膠支持物上，以不同的電泳速度聚集在不同的位置，并可使各種脂蛋白顆粒分離開來，從而呈現(xiàn)出不同的電泳區(qū)帶。將血清脂蛋白先用脂類染料（如蘇丹黑）進(jìn)行預(yù)染，再將預(yù)染過的血清用濾紙插條法（或其他方法）置于瓊脂糖凝膠板上進(jìn)行分離。本實(shí)驗(yàn)電泳系統(tǒng)采用的是pH值為8.6的巴比妥緩沖液，該溶液使得血清脂蛋白均帶負(fù)電荷，通電后，脂蛋白向正極移動(dòng)。電泳一段時(shí)間后，分離為三條區(qū)帶，從正極到負(fù)極依次為α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些）、前β－脂蛋白（最淺）、β－脂蛋白（最深），在原點(diǎn)處為乳糜微粒。也可進(jìn)一步定量分析，電泳后切下各脂蛋白區(qū)帶，分別加熱溶解，冷卻后掃描測定各區(qū)帶吸光度，計(jì)算出α－脂蛋白、β－脂蛋白和前β－脂蛋白的相對百分比。

【實(shí)驗(yàn)器材】

恒溫水浴箱，電泳槽，電泳儀，加樣器，載玻片，濾紙，離心機(jī)，離心管，分析天平，電爐或微波爐，錐形瓶，隔熱手套，分光光度計(jì)。

【藥品及試劑】

蘇丹黑染色液，巴比妥緩沖液，凝膠緩沖液，瓊脂糖，蒸餾水，血清。

【試劑配制】

1.蘇丹黑染色液

稱取0.1g蘇丹黑B，溶于3mL無水乙醇中，使溶液飽和，或制成1%蘇丹黑B石油醚－乙醇（1∶4，體積比）溶液。

2.巴比妥緩沖液

稱取巴比妥鈉15.4g、巴比妥2.76g及EDTA 0.29g，加水溶解后再加蒸餾水至10mL（pH值為8.6，離子強(qiáng)度為0.075）即為電泳緩沖液。

3.凝膠緩沖液

取三羥甲基氨基甲烷1.212g、EDTA 0.29g及NaCl 5.85g，用蒸餾水溶解后，稀釋至1000mL，pH值為8.6。

操作流程

【操作步驟】

1.血清預(yù)染

用加樣器取血清0.2mL置于0.5mL離心管內(nèi)，加蘇丹黑染色液0.02mL，混合后置于37℃恒溫水浴箱中30min，取出離心管，離心（2000r/min）5min，除去多余的染料顆粒，即得染色后血清。

2.瓊脂糖凝膠板制備

用天平稱取相應(yīng)質(zhì)量的瓊脂糖，配制0.45%的瓊脂糖凝膠液。于電爐上加熱融化后稍加冷卻，再均勻澆注在載玻片上，靜置待其凝固。待瓊脂糖凝膠凝固后，距一端2cm處，用寬約15mm的硬濾紙條（或?qū)掕F片）垂直切入凝膠板，再立即取出，打一小槽（1cm×0.1cm），并用濾紙吸去孔槽內(nèi)水分，注意勿將小槽挑破。為避免可能出現(xiàn)載玻片與凝膠分離影響電泳效果的情況，可用滴管滴加一滴凝膠溶液于小槽中再隨即吸出。

3.加樣

用加樣器取經(jīng)預(yù)染過的血清（15～20μL）注入凝膠板上的小槽內(nèi)。

4.電泳

將加完樣的凝膠板平放在電泳槽中，樣品端放于陰極一端。將兩塊四層厚濾紙（或紗布）放入巴比妥緩沖液中浸濕，然后輕輕緊密貼在凝膠板兩端，敷于膠板兩端各1cm左右處，濾紙的另一端“引橋”浸于電泳槽內(nèi)的巴比妥緩沖液中，接通電源，電壓為120～130V，每片凝膠板電流為3～4mA。經(jīng)電泳35～50min，待觀察到染色條帶出現(xiàn)，停止電泳。

5.保存

如果需要保留電泳圖譜，可將電泳后的凝膠板放入干膠機(jī)中制成干膠片。若無干膠機(jī)，可用玻璃紙包好凝膠板（連同載玻片），其上平鋪多層吸水濾紙，濾紙上再壓上書等重物，以吸干凝膠中的水分。也可將凝膠板先放入清水中浸泡脫鹽2h，然后放烘箱（80℃左右）中烘干，但應(yīng)隨時(shí)注意溫度的變化以及凝膠的脫水程度，以避免凝膠在脫水過程中龜裂。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

繪出脂蛋白電泳圖譜，自陰極端起，原點(diǎn)為乳糜微粒（CM），依次為β－脂蛋白（β）、前β－脂蛋白（前β）、α－脂蛋白（α），正?？沙霈F(xiàn)三條區(qū)帶。判斷結(jié)果的方法如下。

1.直觀觀察

可用肉眼直接觀察，以各區(qū)帶顏色深淺、寬窄加以描述。血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3－7所示。

圖3－7　血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖

2.定量分析

（1）切割分光光度法：將凝膠板上的各脂蛋白區(qū)帶分別用刀片切下來，置于盛有3 mL蒸餾水的試管中，另在空白區(qū)切下一塊與脂蛋白區(qū)帶大小相當(dāng)?shù)目瞻啄z作為空白樣，置于另一支試管中。各管置于沸水浴中3min，使瓊脂糖凝膠溶解。待冷卻后，以空白管調(diào)零，于波長660nm處比色，記錄各管吸光度值。以各自區(qū)帶的吸光度值與α－脂蛋白、前β－脂蛋白和β－脂蛋白三條區(qū)帶吸光度值總和之比求其相對百分比。這種半定量方法不夠準(zhǔn)確，誤差很大。

A_x表示各部分脂蛋白x（如α、β、前β）的吸光度。

血清脂蛋白組分的相對百分比計(jì)算公式為：

（2）掃描定量：預(yù)染血清脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳畢，其瓊脂糖凝膠板上有色帶，可直接置于光密度掃描儀中掃描，并得出各區(qū)帶的百分比，如果輸入該患者的血脂總量，即可算出α－脂蛋白、前β－脂蛋白和β－脂蛋白的各自含量。

【注意事項(xiàng)】

（1）標(biāo)本應(yīng)為新鮮的空腹時(shí)的血清樣本。

（2）當(dāng)氣溫較高時(shí)，可將載玻片放在平穩(wěn)的小冰塊上以加速瓊脂糖凝膠的形成；而當(dāng)氣溫很低時(shí)，瓊脂糖完全熱熔后，應(yīng)趁熱迅速、均勻地涂在載玻片上。

（3）血清樣品和染液的比例以9∶1左右為好，染液過多不僅會(huì)稀釋標(biāo)本，而且染液中的乙醇會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，影響分離效果。

（4）瓊脂糖凝膠的濃度為0.4%～0.5%，如果濃度大于1%，β－脂蛋白和前β－脂蛋白不易分開；如果濃度過低，則凝膠的機(jī)械強(qiáng)度太低，不易操作。

（5）制板時(shí)，載玻片應(yīng)水平放置，錐形瓶瓶口垂直于載玻片中央，讓瓊脂糖凝膠快速流出，自然鋪滿整個(gè)玻片，鋪板的凝膠溫度控制在50～60℃為宜。

（6）瓊脂糖凝膠易壞，應(yīng)將鋪好的瓊脂糖凝膠板放在不易碰撞的地方。

（7）加樣時(shí)，血清不能溢于槽外。

（8）用濾紙搭鹽橋時(shí)，樣品端濾紙要小心輕放，不能碰到加樣槽，以免樣品被吸干或?qū)⑿〔劾选?/p>

（9）應(yīng)根據(jù)電泳情況確定電壓、電流，一般α－脂蛋白條帶距離原點(diǎn)2～3cm為宜。

（10）如果需要保存電泳標(biāo)本，可將電泳后的凝膠板，置于清水中浸泡脫鹽約2h，再置于80℃烘箱中烘干即可。

【實(shí)驗(yàn)意義】

1.正常參考值（相對百分比）

（1）α－脂蛋白：20%～40%。

（2）β－脂蛋白：50%～60%。

（3）前β－脂蛋白：13%～25%。

2.意義

血脂高于正常參考值的上限時(shí)即稱為高脂血癥，臨床上常見的有高甘油三酯血癥和高膽固醇血癥。由于血脂以脂蛋白形式在血漿中運(yùn)輸，因此，高脂血癥常伴隨有高脂蛋白血癥。人體體內(nèi)血清脂蛋白成分比例的分析是診斷高脂蛋白血癥的重要依據(jù)。1970年世界衛(wèi)生組織（WHO）建議，將高脂蛋白血癥分為六型，即Ⅰ型、Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅲ型、Ⅳ型及Ⅴ型（表3－6）。其中，Ⅱa型、Ⅱb型、Ⅳ型高脂蛋白血癥是最常見的高脂血癥。脂蛋白電泳對各型高脂蛋白血癥等疾病的診斷具有重要的參考價(jià)值。

表3－6　血清脂蛋白電泳檢測與高脂蛋白血癥分型

本方法比較簡便，重復(fù)性好，但乳糜微粒不夠清楚。樣品槽質(zhì)量好壞對脂蛋白圖譜有直接影響，因此要求樣品槽大小要適宜，邊緣要整齊、光滑。

（1）如果原點(diǎn)出現(xiàn)乳糜微粒、β－脂蛋白、前β－脂蛋白均正?；蚪档?，結(jié)合血清甘油三酯明顯升高，可定為Ⅰ型高脂蛋白血癥。

（2）如果前β－脂蛋白比α－脂蛋白深，結(jié)合血清甘油三酯明顯升高和膽固醇正?；蚵愿?，可以定為Ⅳ型高脂蛋白血癥。

（3）如果β－脂蛋白區(qū)帶比正常血清明顯深染者，同時(shí)結(jié)合血清總膽固醇明顯增高、甘油三酯正常者為Ⅱa型高脂蛋白血癥；若結(jié)合血清總膽固醇增高而甘油三酯略高的前β－脂蛋白略溶者為Ⅱb型高脂蛋白血癥。

（4）如果β－脂蛋白和前β－脂蛋白兩區(qū)帶分離不開而連在一起稱為“寬β區(qū)帶”，結(jié)合血清甘油三酯和膽固醇均有所增高，可定為Ⅲ型高脂蛋白血癥。

能力檢測

一、單項(xiàng)選擇題

1.目前常用于脂蛋白電泳的技術(shù)為（　?。?/p>

A.醋酸纖維素薄膜電泳　　B.轉(zhuǎn)移電泳

C.瓊脂糖凝膠電泳　　　　D.等電聚焦電泳

E.以上皆不是

2.1970年以后世界衛(wèi)生組織將高脂蛋白血癥分為（　?。┬?。

A.2　　B.5　　C.6　　D.7　　E.12

3.正常人空腹血清脂蛋白電泳定量α－脂蛋白正常參考值（相對百分比）為（　?。?/p>

A.20%～40%　　　B.10%～20%　　　C.30%～40%

D.50%～60%　　　E.13%～25%

4.血清脂蛋白電泳與血清蛋白電泳最大的不同在于（　?。?/p>

A.所用的電泳槽不同　　B.電泳支持介質(zhì)不同　　　C.電泳電流不同

D.電泳緩沖液不同　　　E.所用的染料不同

5.正常人空腹12h后抽血做血清脂蛋白電泳，從負(fù)極到正極依次會(huì)出現(xiàn)哪幾條電泳譜帶？（　?。?/p>

A.β－LP、前β－LP、α－LP　B.前β－LP、β－LP、α－LP

C.α－LP、前β－LP、β－LP　D.α－LP、β－LP、前β－LP

E.α－LA、β－LP、前β－LP