雙縮脲法(biurea method)對各種蛋白質(zhì)呈色基本相同,特異性和準(zhǔn)確度高,精密度好,顯色穩(wěn)定,試劑單一,方法簡便,靈敏度雖不高,但對血清總蛋白定量較為適用,是臨床測定血清總蛋白的常規(guī)方法。

【原理】 血清(漿)中蛋白質(zhì)的肽鍵(—CO—NH—)在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。此反應(yīng)和兩分子尿素縮合后生成的雙縮脲(H 2 N—OC—NH—CO—NH 2)在堿性溶液中與銅離子作用形成紫紅色的反應(yīng)相似,故稱為雙縮脲反應(yīng)。這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處有明顯吸收峰,吸光度在一定范圍內(nèi)與血清總蛋白含量成正比,經(jīng)與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較,即可求得總蛋白質(zhì)含量。

【試劑與器材】 可購商品試劑或自配。

1.6mol/L NaOH溶液 稱取NaOH 240g,溶于新鮮制備的蒸餾水(或剛煮沸冷卻的去離子水)約800ml中,冷卻后定容至1L,貯于有蓋塑料瓶中。若用非新開瓶的NaOH,須先配成飽和溶液,靜置2周左右,使碳酸鹽沉淀,其上清飽和NaOH溶液經(jīng)滴定后,算出準(zhǔn)確濃度。

2.雙縮脲試劑 稱取硫酸銅結(jié)晶(CuSO4·5H 2 O)3g溶于新鮮制備的蒸餾水(或剛煮沸冷卻的去離子水)500ml中,加入酒石酸鉀鈉(Na KC4 H 4 O6·4 H 2 O,用以結(jié)合Cu2+,防止Cu2 O在堿性條件下沉淀)9g和碘化鉀(KI,防止堿性酒石酸銅自動還原并防止Cu2 O的離析) 5g,待完全溶解后,再攪拌加入6mol/L NaOH溶液100ml,并用蒸餾水定容至1L,置塑料瓶中密閉保存。此試劑室溫可穩(wěn)定半年,若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn),需要重新配制。

3.雙縮脲空白試劑 除不含硫酸銅外,其余成分與雙縮脲試劑相同。

4.60~70g/L蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液 常用牛血清清蛋白或收集混合血清(無黃疸、無溶血、乙型肝炎表面抗原陰性、肝腎功能正常的人血清),經(jīng)凱氏定氮法定值,亦可用定值參考血清或標(biāo)準(zhǔn)清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)。但定值質(zhì)控血清定值準(zhǔn)確性較差,不能用作血清總蛋白測定的標(biāo)準(zhǔn)物。

5.儀器 自動生化分析儀或分光光度計。

【操作】

1.自動生化分析儀法 參數(shù)設(shè)置參照有關(guān)儀器及試劑盒說明書。

2.手工操作法 按表6-3操作。

表6-3　雙縮脲法測定血清總蛋白操作步驟

混勻,置25℃30min或37℃10min,在540nm處用1cm光徑比色皿比色,用空白管調(diào)零,測各管吸光度。

如遇脂血渾濁、黃疸或溶血標(biāo)本,需做標(biāo)本空白管:取血清0.1ml,加入雙縮脲空白試劑5.0ml,用雙縮脲空白試劑調(diào)零,540nm波長,讀取標(biāo)本空白管吸光度。用測定管吸光度減去標(biāo)本空白管吸光度后的凈吸光度,計算總蛋白濃度。

【計算】

【參考區(qū)間】 成年人65~85g/L。

【質(zhì)量保證】

1.用標(biāo)本空白管消除黃疸、溶血干擾,如標(biāo)本空白管吸光度太高,可影響測定結(jié)果。

2.高脂血癥渾濁血清會干擾比色,可采用下述方法消除:取2支帶塞試管或離心管,各加待測血清0.1ml,再加蒸餾水0.5ml和丙酮10ml,塞緊并顛倒混勻10次后離心,傾去上清液,將試管倒立于濾紙上吸去殘余液體。向沉淀中分別加入雙縮脲試劑和雙縮脲空白試劑,再進(jìn)行與上述相同的操作和計算。

【臨床意義】

1.血清總蛋白升高

(1)血液濃縮:嚴(yán)重嘔吐、腹瀉、高熱、休克,以及慢性腎上腺皮質(zhì)功能減退等,由于水分丟失使血液濃縮,血清總蛋白明顯升高,但清蛋白/球蛋白比值變化不大,稱為假性蛋白增多癥。

(2)合成增加:大多見于多發(fā)性骨髓瘤,主要是異常球蛋白增加,球蛋白可>50g/L,總蛋白可>100g/L。

2.血清總蛋白降低

(1)合成障礙:如慢性肝炎、急性肝細(xì)胞壞死、肝硬化等。

(2)血液稀釋:如靜脈注射過多低滲溶液或因各種原因引起的鈉、水潴留。

(3)丟失過多:如大量失血、腎病綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎等。

(4)其他:如慢性胃腸道疾病,消耗性疾病如嚴(yán)重結(jié)核病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、腎病綜合征、長期營養(yǎng)不良、惡性腫瘤等。